书城医学动物疫病实验室检验技术
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第24章 细菌分离培养及鉴定技术(2)

2.4鸡支原体培养基

制备方法:500g切碎牛心,1000ml水,4℃浸泡过夜,煮沸30min,过滤,补水至1000ml,加入蛋白胨l0g,氯化钠5g,酵母提取液(酵母粉250g,加双蒸水1000ml,煮沸30min,离心取上清,121℃高压15min)10ml,矫正pH至7.8,过滤(若制固体培养基时再加入琼脂),高压消毒后,冷至50℃时,加入20%无菌马血清,加醋酸铊0.02g,青霉素每毫升200IU。分装试管或倾注平皿。

2.5牛肺疫支原体的培养基

成分:每1000ml含有下列物质:

牛心浸膏13g

去氧核酸钠0.02g

蛋白胨5g

PPL0血清组分20ml

氯化钠2.5g

青霉素G 300000IU

磷酸二氢钾2.2g

醋酸铊0.25g

制备方法:加热溶化,调pH至8.5,可补充胆固醇达0.1ug/ml,棕榈酸达5ug/ml。此培养基也叫爱德华氏培养基。

3.用于鼻疽杆菌的培养基

3.1硫堇葡萄糖琼脂

成分:葡萄糖1g

甘油4ml

3%琼脂1000ml

制备方法:上述3种成分混合后,115℃高压灭菌5min。用前加入1%硫堇酒精溶液(用50%酒精溶液)2.5ml,制成平皿即可。

3.2孔雀绿酸性复红琼脂

制备方法:取已溶化的甘油琼脂100ml,加入下述色素溶液,摇匀后,制成平皿即可。

色素溶液配方:0.01%氢氧化钾100m

5%酸性复红水溶液10ml

1%孔雀绿水溶液5ml

各成分分别灭菌后,混合。此培养基可抑制杂菌发育。

3.3甘油琼脂

成分:牛肉汤1000ml

蛋白胨10g

氯化钠5g

琼脂25g

甘油40ml。

制备方法:上述前四种材料混合,加热溶化后加人甘油,调pH至6.8~7.0,分装,以121℃灭菌20min。若为液体培养基,可不加琼脂。

4用于波氏杆菌的培养基

马铃薯培养基:

成分:马铃薯260g

蒸馏水l000ml

牛肉膏5g

氯化钠5g

蛋白胨10g

琼脂30~35g

甘油40ml

制备方法:将马铃薯去皮,削成薄片,每260g薯片中,加1000ml蒸馏水,尽量避免暴露于空气;充分振荡,放55~60℃温箱中过夜;由温箱中取出,纱布过滤;按浸出液量加入牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、琼脂粉,加热溶解;待琼脂溶化后,加入甘油,搅拌均匀,以2mol/L NaOH调pH为7.2~7.6;分装于所需中性容器中,以121℃高压灭菌30min,经37℃培养24—48h,应无菌生长,pH应为6.8~7.0。

该培养基也可用于布鲁氏杆菌、副结核杆菌等的培养。

5用于胎儿弯曲杆菌的培养基

5.1增菌培养基(TEM)

成分:无菌牛血清1000ml

1%敦煌绿5ml

5-氟尿嘧啶0.3g

萘啶铜酸3mg/ml

硫酸多黏菌素B 1000IU/ml

放线菌酮100ug/ml。

制备方法:在无菌工作台中,按标准量混合分装于20ml带胶皮塞(能密闭)的玻璃瓶中,每瓶10ml,然后在100℃蒸气中加温3min,取出冷凝后,用灭菌棒搅拌后加胶塞封闭。再充入微氧气体(3.5%02、10%C02、86.5N2)。

5.2选择性培养基

A.CH培养基(半胱氨酸牛心浸膏培养基)

成分:牛心浸膏500g

右旋葡萄糖l0g

氯化钠5g

卜半胱氨酸1g

琼脂18g

蒸馏水1000ml

制备方法:上述各成分混合,调pH至6.8,121℃30min高压灭菌。待培养基冷却至50℃时,加入100ml绵羊血,多粘菌素B 2IU/ml,Nivoliacin 2ug/ml,放线菌酮20ug/ml。

B.2MH培养基(Mueller Hinton Agar)

成分:牛肉浸膏6g

酪蛋白水解物15.7g

淀粉1.6g

琼脂15g

蒸馏水1000ml

制备方法:混合各成分,调pH至7.6,121℃15min高压灭菌。冷却至50—55℃,加入0.025g的丙酮酸钠、硫代硫酸钠、硫酸亚铁和5%~10%绵羊血及抗生素(杆菌肽2500IU/L,放线菌酮50ug/L,硫酸多粘菌素1000IU/L,先锋霉素V15ml/g,新生霉素5mg/L)。

C.Thiogly Collate肉汤

成分:胰蛋白胨17.5g

植物蛋白胨2.5g

右旋葡萄糖10.0g

氯化钠5.0g

磷酸二氢钾2.0g

硫代乙醇酸钠1.0g

亚甲基蓝0.002g

琼脂0.5g

蒸馏水1000ml

制备方法:上述各成分混合,加热溶解,调pH至7.2±0.2,每管分装15ml,121℃高压灭菌15min即成。

6.用于炭疽杆菌的培养基

6.1溶菌酶-正铁血红素琼脂

成分与制备方法:每毫升蛋白胨营养琼脂中加入正铁血红素(haemation)40ug,溶菌酶60ug。正铁血红素对炭疽杆菌无抑制作用,对其他芽孢杆菌有抑制作用。炭疽杆菌对溶菌酶的抵抗力大于其他芽孢杆菌。

6.2Kinsely氏培养基在Difco牛心浸汤琼脂中加人多粘菌素30IU/ml,溶菌酶40ug/ml,乙二胺四乙酸二钠400ug/ml,醋酸铊40ug/ml。

其他芽孢杆菌在此培养基中不生长,肠杆菌科细菌(除变形杆菌外)亦不能生长。

6.3戊烷脒选择性琼脂

成分:牛肉膏5g

氯化钠5g

蛋白胨10g

琼脂18g

蒸馏水1000ml

制备方法:混合上述各成分,调pH至7.2~7.5,121℃高压灭菌15min,冷至56℃时,加戊烷脒(1:30)水溶液0.1ml,多粘菌素B溶液(10000IU/m1)5ml,牛血或羊血20ml,摇匀,倾倒平皿。

7.用于梭状芽孢杆菌的培养基

7.1含铁牛乳脱脂奶粉培养基

成分与制备方法:含铁牛乳脱脂奶粉(含适量溴甲酚紫)100g,加1000ml蒸馏水,溶化后分装,每管10ml,每管中加人1g清洁的小铁钉,121℃高压灭菌30min(铁钉可重复使用,只须先在5%盐酸内煮沸,再用清水洗净)即可。

7.2硫基乙醇酸盐肉汤

成分:酪胨(酪素胰酶消化液)15g

酵母浸膏5g

葡萄糖5.0g

氯化钠2.5g

L-半胱氨酸盐酸盐0.5g

硫乙醇酸钠0.5g

琼脂(粉)0.5~0.7g

0.2%美蓝溶液0.5ml

蒸馏水1000ml

制备方法:将上述材料混合,然后热热溶解。以2mol/L NaOH液调pH至7.0~7.2,分装于所需中性容器中,以115℃灭菌20—40min。

7.3weinberg氏肉-肝培养基

成分:牛肉(绞碎)500g

胃蛋白酶2g

牛肝(绞碎)100g

蒸馏水加至2000ml

制备方法:调pH至1.8~2.0,45~50℃放置一夜,第2天调pH至7.5,澄清,加入蛋白胨成分1%,葡萄糖成分0.1%~0.5%,115℃高压灭菌15min。

7.4熟肉基(疱肉培养基)将牛肉去筋膜、脂肪、绞碎放于三角瓶中,加等量水,煮沸1h后静置,肉渣下沉,校正pH7.2~7.6。过滤,将肉渣置试管的lcm高,上面再加肉汤高达约4—5cm,液面上加少量液体石蜡,121℃高压灭菌30min。

7.5叠氮钠血琼脂

成分:胰蛋白胨l0g

叠氮钠0.2g

氯化钠5g

牛肉浸膏3g

琼脂15g

蒸馏水1000ml

制备方法:加热溶解上述成分,121℃高压灭菌30min,取出凉至50℃左右,加入脱纤绵羊血5%,再无菌加人0.1%水合氯醛水溶液(0.1g溶于l00ml无菌蒸馏水内)lml,倾注平皿即可。

7.6叠氮钠胰蛋白血液肉汤

成分:牛心浸汤l00ml

胰蛋白胨lg

2%无菌葡萄糖溶液2ml

脱纤兔血5ml

制备方法:前二种试剂混合,121℃高压20min,之后全部混合,分装(2ml/小试管),用时每管加人高压灭菌过的0.1%叠氮钠0.15ml和1:25000的结晶紫溶液0.1ml。

7.7乳糖蛋黄牛乳琼脂

成分:pH7.6牛肉浸汤琼脂100ml

蛋黄盐水(1:1)4ml

20%乳糖溶液6ml

脱脂牛乳15ml

1%中性红溶液0.3ml。

制备方法:先加热溶化琼脂,冷至50℃时,加入已灭菌的其他成分,混匀后,倒制平皿。

8用于结核杆菌的培养基

8.1潘曲吉尼(Pertragnani)氏培养基

成分:脱脂牛奶150ml

鸡蛋4个

马铃薯淀粉6g

鸡蛋黄1g

蛋白胨lg

甘油12ml

马铃薯(去皮切成细丝)75g

2%孔雀绿水溶液3ml

制备方法:首先将脱脂奶、马铃薯淀粉、蛋白胨与切碎的马铃薯混合,水浴煮沸15min,不时摇动,或用玻棒搅拌糊状,继续加热灭菌1h,用灭菌蒸馏水补足蒸发的水分。取出冷至50℃,加入其余成分,用力摇振混匀后,用二层灭菌纱布过滤。用灭菌漏斗分装于试管内,斜置血清凝固器内,调温至85~90℃1~2h,使之完全凝固。间歇灭菌,每次30min,每天一次(第一天85℃,第二、三天80℃)。经检定无菌备用。

注意:所用玻璃器皿应事先灭菌,鸡蛋须事先在烧瓶内加玻璃珠摇碎后倒人。

8.2青霉素血液琼脂

成分:琼脂1.6g

兔全血25ml

中性甘油lml

青霉素(2000IU/m1)1.85ml

蒸馏水74ml

制备方法:将琼脂、中性甘油及蒸馏水混合,121℃10min高压灭菌,冷至50℃时,加人兔血与青霉素,混合,分装试管,制成斜面,换上灭菌软木塞。

9用于副结核杆菌的培养基

9.1丹钦氏培养基

成分:牛肝水(pH6.8~7.2)l00ml

新鲜鸡蛋3个

1%龙胆紫酒精溶液3.5ml

优质甘油l0ml

草分支杆菌甘油浸液6ml

制备方法:将牛肝水、甘油和草分支杆菌浸液混合后,煮沸20~30min灭菌浸出。另取新鲜鸡蛋3个,无菌倒人带有灭菌玻璃珠烧瓶内,充分混匀,混入50℃的肝水混合液中,摇匀。再加龙胆紫酒精溶液,经二层纱布过滤后,分装于灭菌试管内,斜放于血清凝固器内间歇灭菌,第一次85℃30min,第二、三次80℃lh。

9.2改良小川培养基

成分:天冬素1g

磷酸氢二钾1g

优质甘油6ml

草分支杆菌甘油浸液6ml

吐温-801.6ml

2%孔雀绿酒精溶液3ml

蒸馏水100ml

卵黄200ml

制备方法:将前5种成分加入蒸馏水中煮沸20~30min,然后无菌加人搅拌好的卵黄,再加孔雀绿酒精溶液,混匀后,用二层纱布过滤,分装于灭菌试管中,放血清凝固器内,间歇灭菌(同上)。

草分支杆菌甘油浸液制备:将草分支杆菌接种于牛肉汤培养基,把在37℃下培养2周的草分支杆菌培养物过滤,取25g沉淀,悬浮于100ml甘油中,121℃高压灭菌3h即可。

10用于布鲁氏杆菌的培养基

10.1胰蛋白琼脂

成分:胰蛋白20g

琼脂15~20g

盐酸硫胺素0.005g

葡萄糖1g

氯化钠5g

蒸馏水1000ml

制备方法:将上述成分混合,加热溶解;校正pH至7.0,121℃高压灭菌20min后,分装于平皿备用。

此培养基也适用巴氏杆菌、李氏杆菌的培养。

10.2肝汤培养基

成分:牛肝(或猪肝)500g

氯化钠5g

蛋白胨10g

蒸馏水1000ml

制备方法:取去脂肪及筋膜的牛肝,用绞肉机绞碎,按肝水比例混合,搅拌均匀;用不锈钢或耐酸搪瓷缸加温至65~75℃,保温45min,继续加热至煮沸,保持1h,全部过程不断搅拌;煮完后,纱布过滤;按滤液加入上述物质;溶化后调pH至7.0~7.2,分装,121℃高压灭菌30min。或加入3%甘油,0.5%葡萄糖,10%马血清,更有利于生长。如加入30-35g琼脂,则可倾倒平皿。

11.用于真菌的培养基

11.1沙堡罗琼脂:

成分:蛋白胨10g

琼脂20g

麦芽糖40g

蒸馏水1000ml

制备方法:加热溶化,调pH至5.4,过滤分装,115℃高压灭菌20min,做成斜面。

11.2察氏培养基

成分:蔗糖30g

氯化钾0.5g

硫酸亚铁0.01g

硝酸钠3g

琼脂20g

磷酸氢二钾1g

蒸留水1000ml

制备方法:将上述各成分混合,加热融解,调pH值5.5—6.0,分装试管或三角瓶,115℃高压灭菌15—20min,做成斜面或平板.此培养基比沙堡罗氏琼脂营养高,真菌生长较好,孢子形态与色泽也较鲜明。

12.用于钩端螺旋体的培养基

柯托夫(Korthof)氏培养基

成分:蛋白胨0.8g

氯化钾1.4g

氯化钾0.04g

碳酸氢钠0.02g

磷酸二氢钠·2H200.96g

磷酸氢二钾0.18g

1%氯化钙4ml

蒸馏水1000ml

制备方法:将上述物质混合于100℃加热30min溶解,冷后调pH至7.2,若不完全透明或有沉淀,可用G3漏斗过滤,定量分装。以115℃高压灭菌30min;冷后按10%的比例加入无菌新鲜兔血清,再置56—58℃水浴中灭活2h。

13.用于猪血痢密螺旋体的培养基

13.1胰蛋白胨豆胨琼脂(TSA)

成分:胰蛋白胨1.6g

大豆蛋白胨0.5g

氯化钠0.5g

琼脂1.6g

蒸馏水100ml

制备方法:加热溶解,调pH至7.2,过滤,121℃高压灭菌15min,冷却至50℃。加入5%马、牛或绵羊血液。同时加入多粘菌素B2001U/ml。倾倒平皿,备用。