书城医学动物疫病实验室检验技术
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第29章 细菌分离培养及鉴定技术(7)

3.1.3试验方法:将试验菌先划线后穿刺,37℃培养1~2d,阳性者斜面上有细菌生长,培养基由草绿色转为蓝色。阴性者不见有细菌生长,培养基仍为绿色。

3.2丙二酸钠利用试验

3.2.1原理:当细菌利用丙二酸钠作为惟一的碳酸钠,使培养基变碱,呈蓝色。

3.2.2培养基:酵母浸膏1.Og

硫酸铵[(NH4)2SO4]2.0g

磷酸氢二钾(K2HPO4)0.6g

磷酸二氢钾(KH2PO4)0.4g

氯化钠2.0g

葡萄糖0.25g

蒸馏水1000ml

l%溴麝香草酚蓝溶液2.5ml

丙二酸钠3.0g

除指示剂外,各成分混合溶解,调整pH值为6.8,加入指示剂,分装试管,115℃灭菌30min。同时设一份不加丙二酸钠的作空白对照。

3.2.3试验方法:将试验菌分别接种丙二酸钠培养基和空白对照培养基,37℃培养1~2d。如测定培养基有细菌生长并变蓝色,表示试验菌可利用丙二酸盐,为阳性反应。如测定培养基未变色,空白对照培养基也不生长,表示此培养基成分不适于试验菌生长,应另选择合适的培养基进行测定。如测定培养基未变色,而空白对照培养基上能生长,则为阴性结果,表示试验菌不利用丙二酸盐。

3.3醋酸钠利用试验

3.3.1原理:某些细菌可以利用铵盐作为惟一的氮源,同时利用醋酸盐作为惟一的碳源时,可在醋酸盐培养基上生长,并分解醋酸盐生成碳酸盐,使培养基变碱。

3.3.2培养基:氯化钠5.0g

硫酸镁0.2g

磷酸二氢铵1.0g

磷酸氢二钾1.0g

醋酸钠2.5g

琼脂15.0g

1%漠麝香草酚蓝溶液8m1

蒸馏水lOOOml

除指示剂和琼脂外,溶解各成分,调整pH值为6.8~7.0,加入琼脂熔化后,再加指示剂,培养基呈草绿色,分装试管,121℃灭菌20min后摆成斜面。亦可制成液体培养基。

3.3.3试验方法:将试验菌接种于斜面培养基或液体培养基中,37℃培养1—2d,若培养基由草绿色转为蓝色者为阳性反应。

3.4马尿酸钠水解试验

3.4.1原理:B群溶血性链球菌有马尿酸钠水解酶,可使马尿酸钠水解为苯甲酸和乙氨酸,而苯甲酸与三氯化铁相结合,形成稳定的有色的苯甲酸铁沉淀。

3.4.2培养基:牛肉汤培养基100ml

马尿酸(Na-hippumte)1.0g

将马尿酸钠溶解于牛肉汤培养基中,分装于小试管内,加塞包好,置121℃蒸气灭菌20min。

3.4.3试剂:氯化高铁(FeCl3·6H2O)12.0g

2%盐酸100ml

混合溶解。

3.4.4试验方法:将试验菌接种于马尿酸钠培养基上,置37℃培养2~4d。取培养物0.8ml,加试剂0.2ml,立刻混合均匀,经10~15min,观察结果,如管内出现经久不消失的褐色沉淀,则表示马尿酸钠已水解为苯甲酸,是阳性反应。

3.5葡萄糖铵利用试验

3.5.1原理:某些细菌可利用铵盐作为惟一的氮源,且不需要尼克酸和某些氨基酸作为生长因子时,可以在此培养基上生长,分解葡萄糖,使培养基变酸,呈黄绿或黄色。

3.5.2培养基:氯化钠5.0g

硫酸镁0.2g

磷酸二氢铵1.0g

磷酸氢二钾1.0g

葡萄糖2.0g

琼脂20.0g

蒸馏水1000ml

1%溴麝香草酚蓝溶液10ml

除琼脂和指示剂外,各成分溶解后,调整pH值为6.8,加人琼脂熔化后,再加入指示剂,分装试管,115℃灭菌20min,放置斜面。

注:容器使用前用清洁液浸泡过,再用清水、蒸馏水冲洗干净,并用新棉花做棉塞,干热灭菌后使用。如果操作时不注意,有杂质污染时,易造成假阳性。

3.5.3试验方法:用接种环蘸取少量试验菌,在生理盐水管做极稀的菌悬液。将接种环灭菌,再挑取菌悬液少许接种,同时再以同法接种普通琼脂斜面一支作为对照。37℃培养24h。若试验管斜面上有正常大小菌落生长,培养基变黄者为阳性反应;阴性者无菌生长;对照培养基上生长良好。

3.6有机酸盐利用试验

3.6.1原理:酒石酸受细菌酶的作用,分解为乙酸、草酸等比较简单的有机酸。枸橼酸通过三羧酸循环,可被分解为各种比较简单的有机酸,如琥珀酸、乳酸、乙酸等。这些有机酸的生成,可使pH值下降,指示剂颜色由蓝变黄,甚至变白。同时未被分解的酒石酸和枸橼酸与铅离子形成铅盐沉淀,若与阴性对照相比,可以判定反应的程度。细菌对酒石酸异构体的分解具有特异性。黏液酸分解后,可以生成简单的有机酸,用指示剂指示出酸性反应。

3.6.2培养基:蛋白胨10.0g

0.1moL/L NaOH 8.5g

蒸馏水1000ml

1%右旋酒石酸钠2.0g

0.5%左旋酒石酸1.0g

0.5%消旋酒石酸1.0g

1%枸橼酸钠2.0g

l%黏液酸2.0g

0.2%溴麝香草酚蓝溶液12ml(分成5份)

另备5mol的NaOH若干毫升。

取前3种成分混合,加热熔解,分成5份,每份200ml,分别加入以下各试剂1种,待熔解后,分别以5mol/L的NaOH调整到pH7.4。按规定量加指示剂,分装,每管3~4ml,在121℃灭菌20min,置冰箱内备用。

3.6.3试验方法:用接种环由20h的肉汤培养物接种到有机酸培养基上,置37℃培养14d,每天观察记录颜色变化。能分解酒石酸、枸橼酸、黏液酸者,指示剂由蓝变黄绿,直至白色,阴性者仍为蓝色。

在试验结束时,向酒石酸盐、枸橼酸盐管内加0.5ml的醋酸铅饱和水溶液,阳性管只有少量沉淀,阴性管有大量铅盐沉淀,24h后约占2/3液柱高度,与对照管相同。

4.酶类试验及其他试验

4.1氧化酶试验

4.1.1原理:氧化酶即细胞色素氧化酶,在有分子氧和细胞色素C存在时,可氧化盐酸二甲基对苯二胺产生红色反应。若加等量a-萘酚酒精溶液,则形成吲哚酚蓝,出现蓝色反应。

4.1.2试剂:l%盐酸二甲基对苯二胺(或盐酸四甲基对苯二胺)水溶液(装于棕色瓶中在冰箱中贮存)。1%a-萘酚酒精(95%)溶液。

4.1.3试验方法:A.取一张白色滤纸条,滴上1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液,以湿润为宜。用细玻棒(或牙签)沾取幼龄试验菌,涂抹在滤纸条上,10s内出现红色者为氧化酶试验阳性。B.用1%盐酸二甲基对苯二胺液湿润滤纸条后,再加等量的1%a-萘酚酒精溶液,然后再涂抹试验菌,10s内出现蓝色者为阳性。取质量较好的滤纸,先剪成约lcm宽的滤纸条,浸泡在1%盐酸二甲基对苯二胺试剂中(或加等量的1%a-萘酚酒精溶液),在室温下风干,放在带橡皮塞的大试管中,置冰箱中保存数月。使用方法同上。

4.1.4注意事项:A.1%盐酸二甲基对苯二胺溶易氧化,应保存在棕色瓶中,贮存于4℃冰箱中,若溶液变红褐色,不宜使用。B.本试验避免含铁物质。遇铁物质催化盐酸二甲基对苯二胺呈红色反应,造成假阳性,故用细玻棒(或牙签)挑取试验菌。C.在滤纸上滴加试剂,以刚刚打湿滤纸条为宜,如滤纸过湿,会纺碍空气与试验菌接触,而延长了反应时间,造成假阴性。

4.2过氧化氢(触酶试验)

4.2.1原理:有些细菌具有触酶,能催化过氧化氢分解成水和氧。

4.2.2试剂:3%过氧化氢(H2O2)溶液,临用时配制.

4.2.3试验方法:A.取干净的载玻片,在上面滴l滴3%过氧化氢溶液,挑取一环斜面培养的试验菌,在过氧化氢溶液中混匀,若有气泡出现则为阳性,无气泡产生者为阴性。B.取3%过氧化氢溶液2ml加入干净的小试管中,用细玻棒沾取试验菌,插入过氧化氢液面下,若有气泡产生者为阳性。

4.2.4注意事项:因为过氧化氢酶是以正铁血红素作为辅基的酶,所以试验菌不应培养在含有血液的培养基上生长,因为这种培基上生长的细菌易产生假阳性反应。

4.3硝酸盐还原试验

4.3.1原理:某些细菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐,亚硝酸盐与试剂中的醋酸作用,生成亚硝酸,亚硝酸与对氨基苯磺酸作用,生成对重氮苯磺酸,再与a-萘胺偶氮苯磺酸,呈红色反应。

4.3.2硝酸盐培养基:蛋白胨5.0g

硝酸钾0.2g

蒸馏水1000mL

混合上述成分,加热熔解,调整pH值至7.4,分装试管,121℃蒸气灭菌20min备用。

4.3.3厌氧菌硝酸盐培养基:硝酸钾1.0g

磷酸氢二钠2.0g

蛋白胨20.0g

葡萄糖1.0g

琼脂3.0g

蒸馏水1000ml

取上述成分混合,加热熔解,调整pH值为7.2,过滤、分装,121℃蒸气灭菌20min备用。

4.3.4试剂:甲液:对氨基苯磺酸0.8g

5mol醋酸100ml

乙液:a-萘胺0.5g

5mol醋酸100ml

二苯胺试剂:二苯胺0.5g

浓硫酸100ml

蒸馏水20ml

先将二苯胺溶于浓硫酸中,再用蒸馏水稀释。

4.3.5试验方法:将试验菌接种于硝酸盐培养基中,同时设不接种的对照管,于37℃培养3—4d。用两支干净小试管,每天取培养液少许放入试管中,再各滴1滴甲液和乙液,对照管同样加试剂。若试验管菌液呈现红色、橙色者为阳性反应;如无红色出现,则可加1、2滴二苯胺试剂。若呈现蓝色反应,则表示培养基中有硝酸盐存在;如不呈蓝色反应,表示硝酸盐和形成的亚硝盐已被还原成其他物质,仍应按硝酸盐还原试验阳性反应(还原能力强的细菌,可把硝酸盐全部还原成氮)。

4.4卵磷脂酶试验

4.4.1原理:某些细菌产生卵磷脂酶,分解卵黄中的卵磷脂生成脂肪和水溶性的磷脂胆碱,使卵黄发生浑浊现象。

4.4.2培养基。取新鲜鸡蛋,冲洗干净,浸泡在75%酒精15~20min,用无菌纱布擦干。无菌操作打开蛋壳,将蛋黄和蛋白分开,蛋黄盛于含有无菌玻璃珠的三角烧瓶中,加入等量的灭菌生理盐水,用力振摇,制成卵黄悬液。取10ml卵黄液加到已熔化、冷却到50%的200ml营养琼脂中,倾注平板,过夜后使用。或取5ml卵黄液加入灭菌的100ml营养肉汤中,混匀分装无菌试管,制卵黄液肉汤管。

4.4.3试验方法。试验菌点种在卵黄琼脂平板上,每皿可点种3~4株菌。37~C培养24~48h观察,如在菌落周围形成乳白色混浊环者为阳性反应。若试验菌为厌氧菌,则需要点种上面加盖无菌玻片或进行厌氧培养。

4.5磷酸酶试验

4.5.1原理。许多细菌有磷酸酶。它可以使磷酸酯水解。本试验主要用于致病性葡萄球菌与其他葡萄球菌的鉴别,以及沙雷氏菌属与肠杆菌的鉴别。

4.5.2培养基:营养琼脂(pH7.2~7.4)100ml

1%磷酸酚酞溶液lml

取营养琼脂熔化并冷却至50%时,再加入过滤除菌的1%磷酸酚酞溶液,摇匀制成平板。

4.5.3试验方法。将试验菌接种在上述培养基上,37℃培养24h后,打开平板,使培养基表面向下,用浓氨水熏片刻,如有酚酞释出,则菌落变为粉红色,即为阳性反应,否则为阴性。

4.6血浆凝固酶试验

4.6.1原理:病原性葡萄球菌能产生凝固酶,使血浆中纤维蛋白原变成不溶解性的纤维蛋白,附于细菌表面,生成凝块,因而有对抗吞噬的作用。凝固酶试验对于判断菌株是否具有致病力很有帮助。葡萄球菌所产生的凝固酶有两种,一种是与细胞壁结合的结合凝固酶,它直接作用于血浆中的纤维蛋白原,使其发生沉淀,包围于细胞外面凝聚成块,玻片试验的阳性结果就是由此酶引起的。另一种由菌体生成后释放于培养基中,叫做游离凝固酶,它能使凝血酶原变成凝血酶,试管法阳性和其有关系。

4.6.2试验方法:A.载玻片法载玻片一端用蜡笔划直径约1.5cm的圆圈,加生理盐水1滴,挑取菌落浮悬于盐水中,混合均匀,使浑浊似乳后滴加兔(或人)血浆1滴,充分混匀近lmin;玻片另一端以血浆和盐水作对照。有细菌的血浆出现凝块而对照无,为凝固酶阳性;二者均无凝块者为阴性。血浆制备取无菌兔血(或人血)立即与1/5的抗凝剂(0.1%肝素或5%柠檬酸钠)混匀,以1500—3000r/min离心15min,取上清液(下为红细胞等)即为血浆,以新鲜制备为宜。保存于冰箱中的,要经过试验有效才用。B.试管法将新鲜的兔或人血浆用生理盐水作1:4稀释,取0.5ml置于小试管中,挑取几个培养24h的菌落混悬于内使成浓厚的悬液,并用已知阳性菌作对照,共置于37℃水浴中4~6h,每半小时观察1次,全部或部分凝固者为阳性。

4.7DNA分解试验

4.7.1原理:有些革兰氏阳性细菌,产生DNA酶,分解培养基中的DNA,形成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸,而长链DNA可被酸沉淀,寡核苷酸链可溶于酸,在菌落周围形成透明环。

4.7.2培养基:胰酪蛋白胨1.5g

氯化钠0.5g

琼脂1.5g

0.5%甲基绿(经氯仿提纯)lml

O.2mol/L tris pH7.0100ml

各成分混合后,经121℃20min灭菌,取出冷却至500℃左右,加入DNA(1.0g溶于无菌蒸馏水lOOml)lOml倾注平板。