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第56章 分子生物学诊断技术(8)

第七节DNA芯片技术(DNA chips)

DNA传统的测序方法是Maxam和Gilbert的化学法以及Sanger的末端链终止法,但随着分子生物学的发展,近年来一种全新的DNA测序方法,杂交测序以及基于杂交测序发展起来的DNA芯片或叫基因芯片的技术应运而生。DNA芯片能在一次实验中同时自动、快速、敏感地检测数千条序列,而且获得信息高度特异、稳定,被誉为遗传信息方面革命性的里程碑。它可用于基因多态性分析、突变的检测、病原的检测等,DNA芯片技术是当今世界基因序列分析、基因检测的万能钥匙,该技术的发展必将极大地加速诊断技术的发展,使得诊断技术简单化、自动化与现代化。

一、DNA芯片的基本原理

DNA芯片的基础是杂交测序,后者基本原理是:任何线状的DNA或RNA序列均可被测序;反过来,假如我们把原序列中的所有这些错落重叠的8体亚序列全部检测出来,就可以据此重新组建出原序列。对于一个未知DNA序列,可以用人工合成的、已知序列的所有可能的N体寡核苷酸探针与之杂交(在8体寡核苷酸,G、C、T、A四者自由组合而成所有可能的序列共有48=65536中)。通过对杂交的检测,检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸,从而获知靶DNA中的所有8体亚序列,组合分析后者(有电脑软件进行)即可重构靶DNA中的序列,此即SBH。前人的实验充分证明了SBH测序的能力。SBH可分成两种类型:I型,即靶DNA被固定,而被荧光素标记的寡核苷酸探针一个一个与之杂交,最后检出所有能与靶DNA杂交的ODT探针;Ⅱ型,即靶DNA被标记而ODT探针被固定。根据Ⅱ型SBH,采用特殊工艺在一块小的基板上定位合成所有可能的N体ODT探针而形成一个高密、微化的寡核苷酸阵列(ODTA)阵列,这就是DNA芯片。对于阵列上的任一ODT,它的序列都是已知的,且呈一对一的关系。当加人经PCR扩增的、限制性内切酶处理和荧光素标记的一小滴单链靶DNA后,它将以碱基互补配对原则,与芯片上的所有互补的ODT探针杂交,所有这些杂交构成了一个“杂交模式”,即芯片上的所有杂交信号所在位点的综合,它间接反映靶DNA的所有亚序列,计算机通过对这个“杂交模式’’的分析而重建DNA序列。由于杂交反应是平行进行的。故可在同一芯片上一次同时分析多条不同靶DNA序列。

二、DNA芯片的制作

DNA芯片技术的关键在于高密、微化的寡核苷酸阵列(ODTA)的制作,PEASE等人于1994年创造的,光导ODTA化学合成法,为DNA芯片技术奠定了基础。

该合成法有三项基本技术:固相化学,可感光保护基团和照相平版印刷术,后者是该合成系统的基础。

合成反应步骤如下:连接有可感光保护基团X的羟基,通过连接者覆盖于固相基板表面(如玻璃基板),X是可感光保护基团,如NVOC,X与羟基连接时,则羟基不能与加入的脱氧核苷酸发生聚合作用,但暴光可移去X(即光去保护),去掉X的羟基成为有功能的自由羟基,而可与脱氧核苷酸聚合。

加入的反应物是3‘pHospHoramidites激活的、5’端可感光保护的N-乙酰-脱氧核苷对反应起激活作用。合成时,光通过光遮板的一定大小的小孔照射到基板表面的目标合成部位,暴光的部位发生光去保护,X被移去,自由羟基暴露,此时加入第一批反应物,如含T的反应物,即能与暴光部位的自由羟基发生化合反应,第一个反应物被嫁接到目标位置上。然后,光通过第二个遮光板,在新的位置嫁接新的反应物。由于加人的反应物也是含X的,故再次被暴光时,X又被移去,已嫁接上的脱氧核苷酸的自由羟基暴露,可与新加入的反应物化合,从而使寡核苷酸链延长。这样随着反应重复,合成不断进行,最后当所需ODT均合成完毕后,对反应基板进行无遮板的汞光普照,去除所有X,即得到需要的ODTA,这里,光照模式(illumination pattern)和反应物的加入序列决定了合成产物的序列以及在基板上的位置,采用组合合成策略(combinatorial synthesis strategies)使得少的化学步骤能合成最大数量的复合物,如要合成T、C、G、A四个成分所有序列组合的四聚体,可采用下列策略:

整个反应需四个回合,每回合四轮。第一回合自左向右4均分基板,以AGCT的顺序嫁接核苷酸,第二回合同样以AGCT的顺序,自下而上在前面合成的基础上再接上一核苷酸,这样基板上就形成了16个单元,3、4回合即在这每个单元上继续以上述模式嫁接核苷酸。合成结束时,44种四聚体在44次化合反应全部合成,而且每一四聚体的序列、位置均明确知道。用该策略合成一块含所有65536个ODT的芯片只需8h。

由上可知,基板上暴光点越细、越密集,合成的ODTA密度越高,暴光点大小直接取决于遮板透光孔径的大小,而后者因为衍射而最终受限于所用光的波长。1994年PEASE的技术合成65536个ODT探针的芯片只需0.64cm2而近年常用的”半导体光阻“技术可使ODTA密度达到106~107/cm2。

三、芯片杂交的检测方法

靶DNA-ODT探针杂交的检测方法很多,而最被采用的是荧光显影法,简要过程是:靶DNA先被荧光素标记,待与芯片充分杂交后冲洗,用连有”电荷偶连装置照相机”的荧光显微镜分析杂交的荧光信号模式,后者经计算机分析后重建靶DNA序列。激光共聚焦荧光检测是近年广为应用的芯片杂交检测手段,简述如下:

待检品储器中加满荧光素标记的靶DNA溶液,芯片倒置其上,激光从芯片背面射人,聚焦于芯片与靶DNA溶液的相互作用面,这样能与芯片杂交的DNA上的荧光素被激发发光,后者经棱镜后刚好聚焦于空间共聚焦小孔,故能有效通过该小孔而被探测器检测。而焦点外溶液中的荧光信号因不能聚焦于共聚焦小孔,而不能有效通过,故检测不到,这使得冲洗这一步被省去,在数分钟内即可得到一个二维杂交信号模式。并且通过改变系统温度还可获得杂交的热动力学数据。

计算机软件的改造使序列阅读更加直观。另外,若把电子微芯片与CCD结合,作成微芯片CCD,直接放于DNA芯片的下面记录杂交模式,即可使荧光显微镜都不再需要。

四、芯片技术的问题及其进展

DNA芯片技术存在的问题大致可概括为以下3点,随着这些问题的解决,芯片技术本身也不断发展。①靶DNA与ODT探针的杂交存在着错配、未配的情况;②靶DNA自身二级甚至三级结构的形成;③靶DNA存在串联的重复序列会使计算机重构序列时产生分支点而无法排序。这些问题已逐步解决。DNAA的出现使DNA芯片由ODTA扩展到ODTA+DNAA。而“生物芯片”则是一个包含DNA芯片的范畴更广的概念。

五、芯片技术的应用与前景

据以上介绍,基于SBH原理及现代工艺的DNA芯片技术,由于杂交反应的平行性使得它能在一次实验中自动同时、快速、敏感地检测数千条序列,而且获得的序列信息高度特异、稳定,被誉为遗传信息方面革命性的里程碑,可以在病原检测、基因突变的检测及对经传统方法已经测得的序列进行复核。总之,二十世纪末发展起来的DNA芯片技术几乎是当今基因序列分析、基因检测的万能钥匙,该技术的发展及广泛应用必将加速与提高对疾病诊断与防制的水平。