书城医学动物疫病实验室检验技术
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第62章 寄生虫标本的采集、保存和观察方法(1)

第一节剖检动物时寄生虫标本的采集法

采集剖检动物的全部寄生虫标本并进行鉴定和计数,对寄生虫病的诊断和了解寄生虫的流行情况具有重要意义,根据工作要求的不同,可分为寄生虫学完全剖检法、个别器官的寄生虫学剖检法和对某一种寄生虫的采集法。

一、寄生虫学完全剖检法

在动物死亡(或捕杀)后,首先制作血片,染色检查,观察血液中有无寄生虫,尔后仔细检查体表,观察有无体表寄生虫,并收集之。尔后剥皮,观察皮下组织有无虫体寄生。

将各内部脏器依次取出,先收集胸水、腹水,沉淀后观察其中有无寄生虫。然后取出全部消化器官及其所附的肝、胰等腺体。取出呼吸系统、泌尿系统和生殖系统器官,心脏和大的动脉和静脉血管。

要劈开颅骨对脑进行检查,检查脊髓。检查眼和结膜腔,检查鼻腔和额窦,检查唇、颊和舌。采取全身有代表性的肌肉进行检查。

各类器官和检查方法,实际可分为两种:一种如肠、胃是有大量内容物的腔道,应在水中剖开,将内容物洗入液体中,尔后对粘膜循序仔细检查,洗下的内容物则反复加水沉淀,待液体清澈无色为止,再取沉渣进行检查。一种如肝、肺等实质器官,则首先将其撕碎成小块,置37℃温水中,待其虫体自行走出(即贝尔曼法原理),再用手在水中压组织块,将其中残留的虫体挤出,最后将液体经过反复沉淀,检查沉渣。

为了检查沉渣中纤细的较小虫体,可在沉渣中滴加浓碘液,使粪渣和虫体均染成棕黄色,继之以5%的硫代硫酸钠溶液脱色,但虫体着色后不脱色,仍保持棕黄,而粪渣及纤维均脱色,故棕色虫体易于辨认。

现将各系统的检查法分述如下:

1.消化系统先将附着其上的肝、胰取下,再将食道、胃(反刍动物应将四个胃分开)、小肠、大肠、盲肠分别结扎后分离。

食道应剖开,检查食道粘膜下有无虫体寄生,应注意有无筒线虫和纹皮蝇幼虫(牛),在食道浆膜面应检查有无肉孢子虫。

胃和各肠段应分别置于容器内,剖开,加水将内容物洗入水中。仔细检查洗净的胃及肠粘膜上是否附有虫体,并用小刀刮取胃、肠粘膜,将刮下物置解剖镜下检查。洗下物应多加生理盐水,反复地多次洗涤,沉淀,等液体清净透明后,分批取少量沉渣,洗入大培养皿的清水中,先后放于白色和黑色的背景上,寻找虫体。

肝和胰用剪刀沿胆管或胰管剪开,检查其中虫体,尔后将其撕成小块,用贝尔曼法分离虫体,并用手挤压组织,最后在液体沉淀中寻找虫体。

2.呼吸器官用剪刀将鼻、喉、气管、支气管切开,寻找虫体。用小刀刮气管粘膜,刮下物在解剖镜下检查,肺组织按肝脏处理方法。

3.泌尿器官切开肾,先对肾盂作肉眼检查,再刮取肾盂粘膜检查,最后将肾实质切成薄片,压于两玻片间,在放大镜或解剖镜下检查。剪开输尿管、膀胱和尿道检查其粘膜,并注意粘膜下有无包囊。收集尿液,用反复沉淀法处理。

4.生殖器官切开并刮下粘膜,压片检查,怀疑为马媾疫或牛胎儿毛滴虫时,应涂片染色后油浸镜检查。

5.脑先用肉眼检查有无多头蚴,再切成薄片,压片检查。

6.眼结膜和结膜腔以括搔法处理检查,剖开眼球,将前房水收集于器皿中,在放大镜下检查。

7.心和主要血管剖开将内容物洗于生理盐水中,用反复沉淀法检查(对血管内分体吸虫的收集见后)。

8.膈脚特别在猪,应先肉眼检查,见有小白点状可疑物,应剪取置玻片间压薄,在显微镜下检查。

以上是一般动物剖检时通用的方法。对不同的动物,根据解剖构造的差异,方法上有所不同。

在进行以上剖检前,最好先取粪便进行虫卵检查,初步确定该畜体内寄生虫的寄生情况,对以后寻找虫体时可能有所帮助。但也应注意,不要因为粪检结果,而给工作者带来不全面的主观印象,忽视了未在粪便中发现虫卵的那些虫体的寻找。

以上剖检法的工作量极大,因此,在某些情况下为了不同的目的,可采取下列的剖检方法。

二、个别器官的寄生虫学剖检法

有时为了特殊的目的(如检查某一地区某一器官中寄生虫寄生的情况),仅对某一器官进行检查,而对其它器官则不进行检查。

三、个别虫种(即对某一种寄生虫)的采集法

为了一定的目的(如调查某一地区某种寄生虫的流行情况,或某一药品对某种寄生虫的驱虫效果),仅对某一器官中的某种寄生虫进行收集检查。

日本分体血吸虫的收集应采用专用的方法,兹介绍如下:

动物经宰杀停止挣扎后,为防止发生血液凝固,影响虫体收集,应有四个人分别从四条腿开始从速进行剥皮。虽后,将牛头弯至牛体左侧,使牛仰卧成偏左倾斜姿势,剖开胸腔及腹腔,除去胸骨。首先,分开肺找出暗红色的后腔静脉进行结扎。接着,在胸腔紧靠脊柱的部位找到白色胸主动脉,术者左手将其托起,右手用尖头剪刀取与血管平行的方向剪一开口,然后将带有橡皮管的玻璃接管以离心方向插入,并以棉线结扎固定。橡皮管的一端与压缩式喷雾器相接,以备进水。第三,在肾脏后方紧贴脊柱处,同时结扎并列的腹主动脉和后腔静脉,以免冲洗液流向后躯其它部分。第四,在胆囊附近,肝门淋巴结背面,细心地分离出门静脉,向肝的一端紧靠肝脏处先用棉线扎紧,离肝的一端取与血管平行的方向剪一开口(应尽可能靠近肝脏,以免接管进入门静脉的肠支,而影响胃支中虫体的收集),插入带有橡皮管的玻璃接管,并固定之。为防止凝血,接管内应事先装满5%柠檬酸钠溶液,在插入接管时此溶液即倾入血管中。橡皮管的一端接有铜丝筛,以备出水收集虫体。手术结束后,即可启动喷雾器注入0.9%加温至37~40℃的食盐水进行冲洗,虫体即随血水落入铜丝筛中,直至水液变清,无虫体冲出为止。

第二节蠕虫标本的采集、保存和观察方法

一、吸虫的采集保存

1.采集在各脏器中或其冲洗物沉淀中,如发现吸虫时,应以弯头解剖针或毛笔将虫体挑出(注意!不应采用镊子夹取,否则镊子夹住的部位,会使虫体损坏变形,影响以后的观察)。挑出的虫体,体表常附有粪渣、粘膜等污物,应先放入1%的盐水溶液中。较小的虫体,可和盐水放入小试管中,加塞塞紧,充分振荡将污物除去洗净。较大的虫体可用毛笔刷洗。有些虫体的肠管内含有大量的食物,可在生理盐水中放置过夜,等其食物消化或排出。

2.固定法标本洗净后,较小的虫体,可先在薄荷脑溶液中使虫体松驰。薄荷脑溶液的配制是取薄荷脑(Menth01)24g,溶于100mL 95%的酒精中,为薄荷脑饱和酒精溶液,使用时将此液一滴,加入l00ml水中即可。

在上液中松弛的虫体,即可投入下述固定液中固定。较大较厚的虫体标本,为了以后制作压片标本的方便,可将虫体先压入两载玻片间,为了不使虫体压得过薄可在玻片两端垫以适当厚度的纸片,尔后以橡皮筋扎紧玻片两端。

固定吸虫时常用的固定液有如下各种:

1.1劳氏(Looss)固定液:适用于小型吸虫。取饱和升汞溶液(约含升汞7%)100ml,加冰醋酸2ml,混合即成。固定虫体时,将虫体放于一小试管中,加入盐水,达试管的1/2处,充分摇洗,再加入劳氏固定液摇匀,12h后,将虫体取出移入加有0.5%碘的70%的酒精中,并更换溶液数次,直到碘酒精溶液不再褪色为止,再将虫体移到70%酒精溶液中保存,若欲长期保存应在酒精中加5%甘油。

1.2酒精-福尔马林-醋酸固定液(A.F.A固定液):本液以95%酒精50份,福尔马林(实含甲醛40%)10份,醋酸2份,水40份混合而成。大型的已夹于玻片间的虫体,可浸入此固定液中过夜。小的虫体可先放于充满2/3生理盐水的小瓶内,用力摇振,待虫体疲倦而伸展时,再将盐水倾去1/2,再加入本固定液,放置过夜。次日将虫体取出,保存于加有5%甘油的70%酒精中。

1.3福尔马林固定液:取福尔马林1份与水9份混合即得。将小型吸虫虫体或夹于玻片间的虫体投入固定液中,经24h即固定完毕。较大的夹于两玻片间的吸虫,固定液渗入较难,可在固定数小时后,将两玻片分开,这时虫体将贴附于一玻片上,将附有虫体的玻片继续投人固定液中过夜。最后将虫体置3%~5%的福尔马林溶液中保存。

经以上三种方法中任何一种固定的标本,在保存时均应给以标签。标签应用较硬的纸片(如道林纸)用铅笔书写,内容应包括标本编号、采集地点、宿主及其产地、寄生部位、虫名、保存液种类和采集时间,将以上内容一式两份书写,一份与虫体一同放于瓶内,一份贴于瓶外。

在采集标本时,尚应有登记本,将标本采集时的有关情况,按标本编号,记于登记本上。对虫体所引起的宿主的病理变化也应做详细的记载。

吸虫标本的形态观察,常需制成染色装片标本或切片标本。切片标本的制作与组织切片相同。整体装片标本的制法有以下数种。

1.苏木素法常用的为德氏(Delafield)苏木素染液,其配法如下:先将苏木素4g溶于95%酒精25ml中,再向其中加入400ml的饱和铵明矾(Ammonium Alum)溶液(约含铵明矾11%)。将此混合液曝晒于日光及空气中3~7天(或更长时间),待其充分氧化成熟,再加入甘油100ml和甲醇l00ml保存,并待其颜色充分变暗,滤纸过滤,装于密闭的瓶中备用。染色时步骤如下:

1.1将保存于福尔马林溶液中的虫体,取出以流水冲洗。如虫体原保存于70%酒精中,则先后将虫体移经50%和30%酒精中各1h,再移入蒸馏水中。

1.2将德氏苏木素染液加蒸馏水10—15倍,使呈浓葡萄酒色。将以上虫体移入此稀释的染液内,染色过夜。

1.3取出染色后的虫体,在蒸馏水中除去多余的染液,再依次通过30%,50%,70%酒精各0.5~lh。

1.4虫体移入酸酒精中褪色(酸酒精是在80%酒精100ml中加入盐酸2m1),待虫体变成淡红色。

1.5再将虫体移回80%酒精中,再循序通过90%,95%和l00%酒精中各0.5~1h。

1.6将虫体由l00%的酒精中移入二甲苯或水杨酸甲酯(亦称冬绿油或冬青油)中,透明0.5~lh。

1.7将透明的虫体放于载玻片上,滴一滴加拿大树胶,;加盖玻片封固,待干,即成。

2.卡红染色法以卡红为原料,常用的染色液有盐酸卡红和硼砂卡红等。

盐酸卡红的配制是以蒸馏水15ml加盐酸2ml,煮沸,趁热加入卡红染粉4g,再加入85%的酒精95ml,再滴加浓氨水以中和,等出现沉淀,放凉,过滤,滤液即为盐酸卡红染液。

硼砂卡红是以4%硼砂(Na2B4O7)溶液l00ml,加入卡红染粉1g,加热使其溶解,再加入70%酒精100ml,过滤,滤液即为硼砂卡红染液。

染色方法是:

2.1原保存于70%酒精内的标本,可直接取出投入染色液中染色。保存于福尔马林液内的虫体标本,应先取出水洗1~2h,尔后循序通过30%,50%,70%的酒精各0.5—lh,再投入染液中,在染液中过夜使虫体染成深红色。

2.2自染液中取出虫体,放入酸酒精中褪色,(酸酒精是以70%酒精l00ml加浓盐酸2m1),使颜色深浅分明,即虫体外层呈淡红色,内部构造呈深红色。

2.3虫体移人80%,95%和纯酒精中各0.5~1h。

2.4移入二甲苯或水杨酸甲酯中透明。

2.5已透明的虫体,移置载玻片上,加一滴加拿大树胶,加盖玻片封固。

二、绦虫的采集保存

1.采集绦虫大部分寄生于肠管中,并以头节牢固地附着于肠壁上。采集标本时,为了保证虫体的完整,切勿用力猛拉,而应将附着有虫体的肠段剪下,连同虫体浸入水中,5~6h后,虫体会自行脱落,体节也自行伸直。

2.固定将收集到的虫体,浸入劳氏固定液,70%酒精或5%福尔马林液中固定。准备做瓶装陈列的标本,以福尔马林溶液固定较好。如欲制成染色装片标本以观察其内部结构,则以劳氏固定液或酒精固定为好。

绦虫有时很长(可达数米),易于断裂而又易于相互缠结,故固定时应注意。不太长的虫体,可提住虫体后端,将虫体悬空伸长,尔后将虫体下放,逐步地浸入固定液内。过长的虫体,可先绕于一玻璃瓶上,连瓶浸入固定液内。亦可在大烧杯中,先放人以固定液浸润的滤纸一张,提取虫体后端,使虫体由头节始,逐步放落在滤纸上,加盖一层湿滤纸;再以同样操作,放上第2条虫体;如是操作,全部放好所有虫体,最后将固定液轻轻注满烧杯内,固定24h后取出。

保存于瓶内的标本应登记并加标签,其注意事项同吸虫。

3.绦虫制片法绦虫虫体较长,因此,制片时要切断虫体,根据观察的需要,采取一定部位的节片,染色后做成装片标本。绦虫的头节是决定绦虫种类的重要依据之一,应选为装片标本的材料;此外,成熟节片和孕卵节片,亦常各切取3~5节,制成染色装片标本。其染色和装片方法与吸虫同,可参阅吸虫的有关资料。