安庆失守后8个月，湘军主力曾国荃部的陆军，彭玉麟部的水师，顺江东下，先后占领东、西梁山、和州、巢县，于1862年5月底逼进天京。陆军驻扎雨花台，水师停泊护城河。这样，历时两年零50天的天京保卫战就此开始，这是太平天国与清王朝之间生死存亡的大决战。
湘军水陆主力直逼天京城下，其进军速度之快，出乎曾国藩预料，更使洪秀全感到突然。6月8日，洪秀全命天京守军约2万人出战，被曾国荃击败退回城内。初战失利，洪秀全焦躁不安，一日三下诏，命正在松江与侵略军激战的李秀成率大军回援天京，并派专使至苏州坐催，面责李秀成有独立称王之意。洪秀全与李秀成的矛盾完全表面化了。本来，洪秀全深深担心李秀成权力过大，难于驾驭，就在1862年一年内，先后分封李秀成部下陈坤书、童容海、谭绍光等10余人为王。这种作法虽然达到了分割李秀成指挥权的目的，但此例一开，封王之滥一发而不可收，到1864年竟封王2000多个，这与天国初期6王相比，差别何等悬殊。
李秀成于1862年6月在苏州召开军事会议，议定大军暂不回援，但从苏州调运大量军火粮食，并抽调一部分军队支援天京，增强天京防御能力。但当李秀成感到洪秀全怀疑自己别有他志时，便于八月初在苏州召开第二次军事会议，议定兵分三路，回援天京。杨辅清进攻皖南宁国，陈坤书等进攻长江南岸重镇金柱关。这两路的主要任务是阻止曾国荃的援兵。李秀成亲率主力进攻天京城下的曾军营垒。大战开始后，侍王李世贤又率部从浙江来天京会合。一时天京城下太平军云集，号称60万，实数达20万。
李秀成指挥太平军包围雨花台，对东西两路敌人发动全线攻势，将队伍分成两部分，不分昼夜，轮番猛攻。或挖地道，用炸药爆破敌垒；或捆草填壕，奋勇冲锋。战斗异常激烈，双方伤亡惨重。曾国荃也负了伤。但是，湘军战斗力比绿营、八旗兵顽强得多，太平军虽作战英勇，而敌人也拼命顽抗，有时甚至反冲锋，战斗形成激烈的相持状态。
敌人之所以能顽抗到底，一个主要原因是有长江水师的支援，粮饷、军械、援兵源源不断，而太平军不但粮食供应困难，而且时至初冬，尚无寒衣，长期坚持大兵团攻坚战有实际困难。李秀成不得不在11月中旬停止对曾国荃营的进攻，下令撤兵，退入天京城内。洪秀全谴责他作战不力，革除了他的爵位。
破围战失败后，洪秀全命令李秀成率太平军执行“进北攻南”的新计划，就是再次采用1860年破江南大营的策略，令李秀成渡江北攻，进军安徽、湖北，会合西北太平军陈得才部，把战火引向敌人后方，威胁华中重镇武昌，切断湘军补给线，迫使长江下游和天京外围的敌军回师救援，这就会给太平军造成歼敌的机会。
1862年12月初，李秀成派林绍璋、洪春元等率一部分兵力渡江去皖北，他本人于次年2月底集中约30万兵力渡江北上。由于当时沿途各地已被敌人破坏得一片荒凉，粮食供应困难，加上处处受到阻截，队伍遭到严重损失。陈得才率领的西征太平军被清军阻挡在武汉以北的黄安（今红安）、麻城一带，没有达到会师的目的。而这时湘军窥破太平军战略，更死死咬住天京，加紧围攻。李秀成到达天长后，因天京形势紧急，洪秀全又命令他速回天京。“进北攻南”战略又失败了，反而损失了十几万人。李秀成率疲惫之师，于6月返回天京。
从1862年6月到1863年6月，在1年的时间里，太平军以解救天京之围为中心任务，进行了顽强战斗，但不论是破围战，还是“进北攻南”之战，都未能成功，而且消耗了大量有生力量。从此以后，太平军就无力再组织大规模的进攻，不得不转入凭借城防工事的消极防御了。相反地，清军却取得了战略上的主动权，由原来的坚守顽抗转为疯狂的进攻。
1863年11月，清军已攻陷天京外围和长江以北所有城镇、要塞，外援断绝，天京已肯定守不住。李秀成向洪秀全建议：撤出天京，迁都武汉、江西，据上游以号令天下，进可以直捣北京，退可以入川黔粤西。然而，由于太平天国连遭挫折，洪秀全产生焦躁执拗心理，不愿战略退却，固执地要和敌人拼消耗。他严厉斥责李秀成，自欺欺人地宣称皇上帝会来帮助自己，他说：“朕奉上帝圣旨，天兄耶酥圣旨，下凡作天下万国独一真主，何惧之有！不用尔奏，政事不用尔理，尔欲出外去，欲在京，任由于尔。朕铁桶江山，尔不扶有人扶。尔说无兵，朕之天兵多过于水，何惧曾妖乎！”这些梦话般的言语，表明洪秀全已深深陷入宗教迷信的泥潭。
1864年2月28日，天京城外制高点天堡城陷落，清军架设大炮百余尊，对天京城内日夜轰击，又以炮火为掩护，在城墙下挖掘地道，准备用火药炸城。天京城破就在眼前，洪秀全精神上受到沉重打击，加上因缺粮而带头吃“甜露”（即野草），身染重病，他拒绝食药医治，1864年6月3日病逝。他儿子洪天贵福即位，称幼天王。
6月18日，李秀成从太平门突围没有成功。7月19日，清军从地道用火药炸塌城垣20余丈，冲入城内，太平军与敌人展开逐屋争夺战，数千守军壮烈战死。
清军破城后，见男人和老幼就杀，见妇女就掳，见财物就抢，全城一片火海，燃烧达七八昼夜之久。曾国荃和其他湘军将领分得大批赃物而成巨富，仅曾国荃就回湖南置田百顷。
洪天贵福和李秀成在城破时突围而出，不幸失散，先后被清军俘获遇害，洪仁玕也在江西被俘遇害。
天京的陷落标志着太平天国运动的失败，但是太平军余部仍活跃在大江南北，坚持战斗达四年之久。
侍王李世贤率太平军从江西转入福建南部，攻克漳州和龙岩。另一部太平军也自江西到达汀州。他们在闽南建立了一个坚持半年的根据地，并大破福建的清水军和陆军。在中外反动派的围攻下，突围的一部分太平军转入了广东，到1866年全部牺牲。
原由西北回援天京的一支太平军、捻军联合部队，在天京陷落后，一致接受太平天国遵王赖文光的领导。赖文光按太平军的兵制和纪律整编了捻军。1865年5月，新捻军在山东曹县设下埋伏，歼灭以凶悍著称的僧格林沁所率骑兵。1866年10月，捻军在河南分为东西两支队伍，一直战斗到1868年8月，新捻军是太平天国运动的后继者，显示了太平天国的巨大影响。
太平天国运动的失败说明，农民阶级由于其小生产者的局限性，缺乏远大的政治眼光，提不出正确可行的行动纲领和政治路线，不能够长期保持严密的组织纪律。太平天国一些领导人随着权力威望的提高，滋长了骄傲自满、享乐腐化思想，导致脱离群众，高高在上，争权夺利，自相残杀，演出了一幕可叹的历史悲剧。
但太平天国运动以暴风骤雨之势，极其沉重地打击了腐朽落后的封建势力，对于外国侵略者也进行了英勇的抗击，同时担负起了反封建和反帝的重任，成为中国近代旧民主主义革命的第一次高潮。