2.核分离和染色程序的多步法
（1）细胞核分离-染色液的配制
①枸橼酸冲洗液：将85.5g蔗糖（250mmol／L）和11.76g枸橼酸三钠·2H2O2（40mmol／L）溶于约800ml蒸馏水中，再加入50ml 二甲基亚砜（DMSO），加入蒸馏水至总体积1000ml（pH7.6）。
②贮液：贮液用于制备A 液，B 液、C 液和流式细胞仪鞘液。
将2g柠檬酸三钠·2H2O2（3.4mmol／L）、2mlNP40（0.1％V／V）、104mg四氯酸精胺（1.5mmol／L）、121mg羟甲基甲胺（Tris）（15mmol／L）加入蒸馏水，使总体积为2000ml，调整pH 至7.6。
A 液：将15g胰酶溶于500ml贮液中（pH7.6）。
B 液：将250mg胰酶抑制剂和500gRNA 酶溶于500ml贮液中（pH7.6）。
C 液：将208gPI和500mg 四氯酸精胺加至500ml贮液中（pH7.6），避光保存。
③染液的长期贮存方法：将5ml 染液分装在塑料管中，－80℃下贮存。使用前，将贮存的染液立即置入37℃的水浴中，然后将A 液和B 液在室温下保存，C 液保持在冰浴中。
④细胞长期贮存方法：将柠檬酸缓冲液分装在冻存管中（400μl／管，每管可悬浮大约106个细胞），置于液氮中存放；或将冻存管置于干冰和99％乙醇中，存贮于－80℃冰箱中。检测前，先将样品迅速置于370℃水浴中复苏和染色。
（2）核分离和染色程序
①将1.8ml的A 液加入0.2ml柠檬酸缓冲液的细胞悬液中，将试管缓慢倒置，混匀。
②室温下，10分钟内将管轻轻上下倒置5次或6次。
③加入1.5mlB 液，10分钟内轻轻倒置几次。
④加入1.5mlC 液（原在冰浴中），轻轻将管倒置。
⑤通过350目的尼龙网过滤样本，加入C液染色后上机分析。
（三）石蜡包埋组织单细胞悬液的制备
1.制备40～50μm 厚的石蜡包埋组织切片若干张。切片不可过薄或过厚，过薄碎片多，过厚则脱蜡不易干净。
2.将切取的组织片放入试管中。
3.加入3～5ml二甲苯进行脱蜡，一般需要1天或2天，根据石蜡脱净与否可换一次二甲苯；待石蜡脱净后，弃去二甲苯。石蜡脱净时，无絮状物浮起。
4.依次加入100％、95％、70％和50％的梯度乙醇各5ml进行水化，每步水化10分钟，最后加入蒸馏水3.5ml，3～5分钟后弃之。
5.加入5ml胃酶消化液（0.5％），置于37℃恒温水浴中消化30分钟。消化期间每隔5～10分钟振荡一次。消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化。
6.消化30分钟后，立即加入生理盐水以终止消化。
7.经300目的尼龙网过滤。为使组织片完全消化，也可进行二次消化。
8.收集细胞悬液，离心（1500rpm）沉淀后再以生理盐水漂洗1次或2次，低速离心（500～800rpm）沉淀，以去除细胞碎片。
9.用制备好的细胞悬液作涂片，AO 染色；在荧光显微镜下观察，应为完整细胞核，细胞核呈现黄绿色荧光。
10.单细胞悬液样品以预冷的70％乙醇固定待检。
11.使用PI或EB 染色，必须先用新配制的0.1％的RNA 酶（PBS中）在37℃下处理1小时，离心后再将沉淀悬浮于10μg／ml PI或EB 中染色，在4℃暗处待测。
（四）血液单细胞悬液的制备和检测项目
1.应用淋巴细胞分离液分离血中的单个核细胞（淋巴细胞、单核细胞、白血病细胞和网织红细胞等）。一般将100U 肝素加入1ml全血中，进行抗凝。淋巴细胞分离液有商品供应。
2.进一步分离和纯化淋巴细胞或单核细胞的方法（1）贴壁法：将分离出来的细胞置入玻璃平皿中，于37℃温箱中静置2小时，待单核细胞贴附于玻璃平皿后，吸出未贴附的游离细胞即为较纯的淋巴细胞。
（2）抗体和（或）补体工作液：用相应的单克隆抗体结合细胞表面抗原，在补体存在的情况下，杀伤表达相应特异性抗原的细胞。
（3）磁力离心法：将吸附相应单克隆抗体的微球与血细胞混合，然后用磁力离心机将需要的细胞分离出来。由于微球的直径仅有数微米，所以不会影响所分离细胞的生物学特性。
3.检测项目
（1）应用标记了荧光素的相应单克隆抗体可以定性或定量检测细胞膜抗原，例如检测血细胞的免疫表型。这是进行免疫学诊断和临床治疗的一项重要指标。
（2）检测白血病细胞的DNA 和进行细胞周期分析，可作为评估化疗疗效、预后和是否复发的重要参考指标。
（3）应用DNA 与荧光素化学结合的染色反应来推算细胞的倍体和细胞周期。
（五）细胞培养液中单细胞悬液的制备
1.悬液中获取的细胞数量必须足够多，形态必须完整。
2.对于贴壁生长细胞，适当应用酶消化法（0.29％胰酶）是获取完整细胞的关键。在显微镜下观察到细胞间出现裂隙时应终止消化，然后用吸管吹打分散成单细胞，收入离心管中。
3.有必要适当配合应用0.04％EDTA 来解除细胞问的联结。
4.低速（800～1000rpm）离心5分钟；弃上清液，加冷PBS（pH7.4），均匀吹打，再次用PBS（pH7.4）均匀吹打，低速（800～1000rpm）离心3次，3～5分钟／次，以去除悬液中的细胞碎片。
5.将细胞沉淀轻轻吹打均匀，加0.5mlPBS，根据实验目的选择染液，在4℃冰箱染色，然后上机检测。
6.每份样本中的细胞数一般不应少于106个。
7.尽量减少细胞洗涤过程。用荧光素直接标记的单抗可减少洗涤次数。进行DNA 染色时，细胞分散均匀时也无需多次洗涤。
8.以悬浮法培养的细胞或细胞悬浮生长，则不需消化。
9.用贴壁细胞或悬浮细胞制作的FCM 样品中，死细胞均不宜超过5％，以免影响测试结果。
（六）胸水、腹水、细针穿刺物等单细胞悬液的制备参见“细胞培养液中单细胞悬液的制备”。
三、细胞表面抗原、DNA 的定量检测
（一）细胞表面抗原的免疫荧光检测
1.直接免疫荧光染色法
（1）将单细胞悬液加入试管中，轻轻倾斜试管，将上清液吸除。
（2）加入冷PBA200μl，离心洗涤，弃上清液［PBA 为等渗磷酸盐缓冲液（PBS）加2％牛血清蛋白，加0.1％叠氮钠］。
（3）加入用PBA 稀释的荧光素标记的单克隆抗体200μl（稀释倍数由预实验确定）［其中一组试管中加入用同样荧光素标记的正常小鼠IgG（或IgM）作为对照］，用微量加液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30分钟。
（4）离心后弃上清液。
（5）加入冷PBS200μl，离心洗2次，以除去未结合的多余抗体成分。
（6）向细胞中加入冷PBS200μl，吹打混匀，置测试管中，4℃避光保存，待测。
2.间接免疫荧光染色法
第（1）、（2）步同直接免疫荧光染色法。
（3）加入用200μlPBA 适当稀释的小鼠抗人某种抗原的单克隆抗体（第一抗体）和正常小鼠IgG（对照），轻轻吹打混匀，4℃或置冰浴中孵育30分钟，离心，弃上清液。
（4）冷PBA 离心洗涤一次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
（5）加入用PBA 适当稀释以荧光素标记的第二抗体---羊抗鼠IgG-FITC（或IgM-FITC）200μl。吹打混匀，4℃或置冰浴中孵育30分钟，避光。
（6）冷PBA 离心洗涤2次。
（7）将细胞重新悬浮于200μlPBS 中，混匀，置流式测试管中，避光，4℃冰箱保存，待测。
（二）DNA 定量分析的染色方法
较常用PI荧光染色法，参见本节“新鲜实体瘤单细胞脱核悬液的制备”。
四、细胞凋亡检测
（一）亚“G1”峰检测法
原理：处于增殖周期中的细胞，根据其所处不同周期时相（G0／G1、S、G2／M），其DNA 含量分布在2n～4n之间。发生凋亡的细胞由于核内DNA 裂解成许多小片段，在乙醇固定后用细胞膜通透剂使小分子量的DNA 片段穿过细胞膜而丢失，仅剩下大片段DNA，这些失去部分DNA 含量的细胞，在DNA 染色后，形成一个DNA 含量＜2n（即＜G1期细胞）的分布区，称为“亚G1峰”。
1.样品来源
（1）悬浮生长的培养细胞。
（2）贴壁生长的培养细胞经胰酶蛋白酶消化后的细胞悬液。
（3）离体细胞悬液。
2.样品分组
（1）空白对照组（未经诱导凋亡处理组）。
（2）实验组（经诱导凋亡处理组）。
3.材料和试剂
（1）PBS缓冲液。
（2）70％乙醇。
（3）DNA 抽提缓冲液：取192ml0.2mol／L Na2HPO4，与8ml0.1mmol／L 枸橼酸混合，调整pH 至7.8。
（4）DNA 染液：取200μgPI溶于10mlPBS，加入2mg 无DNA 酶活性的RNA 酶。
4.操作步骤
（1）（1～5）×106个细胞，用70％乙醇固定（0～4℃冰箱），2小时以上。
（2）洗涤离心，弃乙醇，细胞重新悬浮于10mlPBS 中，再离心，弃上清液。
（3）DNA 片段抽提：将细胞重新悬浮于0.5mlPBS 中，加入1mlDNA 抽提缓冲液，混匀，室温下静置5分钟，离心，弃上清液。
（4）DNA 染色：将细胞重新悬浮于1mlDNA 染液，室温下避光染色30分钟。
（5）流式细胞仪测定：选用波长为488nm 的激发光，同时测定红色荧光和前向角散射光，每例样品测定5000～10000个细胞。
所有离心步骤均为1000rpm，5分钟。
（二）末端脱氧核苷酸（TdT）转移酶标记技术1.原理经末端脱氧核苷酸转移酶标记后的细胞（带有绿色荧光－FITC），再经DNA 荧光染色（红色荧光-PI）后，这种带有双重荧光信号的细胞经流式细胞分析检测，可显示出不同周期时相的细胞凋亡情况。
2.样品来源由培养细胞或离体细胞制成的单个细胞悬液。
3.材料和试剂同原位末端脱氧核苷酸转移酶荧光标记技术。
4.操作步骤
（1）固定：收集（1～5）×106个细胞于离心管内，离心，弃上清液，重新悬浮于5mlPBS 中；再离心，弃上清液。用1％多聚甲醛悬浮细胞，4℃冰箱内固定15分钟后，离心，弃固定液，用80％乙醇再固定2小时（0～4℃冰箱内）。
（2）洗涤：将样品离心，弃乙醇，重新悬浮于5mlPBS 中，离心，弃上清液。重复此步骤2次。
（3）平衡处理（此步骤仅用于Oncor公司试剂盒）：将样品离心后吸去上清液，每管加入75μl平衡缓冲液，用吸头反复吹吸数次，室温下静置5～10分钟。
（4）反应：离心，吸去平衡缓冲液，每管加入反应液54μl（18μlTdT 酶＋36μl反应缓冲液），用吸头反复吹吸数次，离心管加盖，置37℃水浴箱内温育30分钟（每10分钟摇动离心管以悬浮细胞）。
（5）终止反应：直接向离心管内加入5ml终止和（或）洗涤液，继续孵育10分钟，离心，弃去上清液，重复此步骤1次。
（6）洗涤：向离心管内加入5mlPBS，重新悬浮细胞。
（7）FITC 标记：样品离心后，弃上清液，每管加入100μl FITC 反应液（含亲合素-FITC，或链霉亲和素-FITC，或抗地高辛-FITC），室温下避光孵育30分钟。
（8）洗涤：直接向离心管内加入5mlPBS。
（9）PI复染：样品离心后，吸去上清液，每管加入0.5～1ml PI染液（根据每管细胞数目），反复吹吸使呈单个细胞悬浮，室温下避光染色30分钟。
（10）流式细胞分析检测：FACScan 流式细胞仪，采用波长为488nm 的激发光，检测绿色荧光［FITC，波长（530±30）nm］和红色荧光（PI，波长＞620nm）。
聚合酶链反应（PCR）和病理分子生物学技术一、概述病理分子生物学技术主要包括目前广泛应用的聚合酶链反应（PCR）技术、原位凋亡杂交（TUNEL）技术和基因重排技术，也有已开展应用的染色体制备应用技术（FISH 和CGH）和基因测序技术等。
开展上述分子生物学技术项目，应按照国家相关实验室规定，对于人员、仪器、试剂和操作规程进行项目管理，未达相应要求的实验室，原则上不得开展活病毒的实验项目，并做好防止污染物、放射物、毒物排放和标本存放、消毒和溯源资料管理工作。
二、聚合酶链反应（PCR）技术
（一）试剂、仪器
1.纯化的模板DNA（待测样品DNA）。
2.寡核苷酸引物。
3.TaqDNA 聚合酶。
4.催化PCR 的反应缓冲液（10×）
KCl500mmol／L
Tris－HCl（pH9.0，0.25℃）100mmol／L TritonX－1001％5.MgCl225mmol／L。6.去离子水。
7.dNTP 混合液，每种10mmol／L。
8.无核酸酶活性的矿物油。
9.PCR 扩增仪。
10.琼脂糖凝胶电泳装置。
11.凝胶电泳自动显像系统。