第一节 标本的采集和申请单、标本的验收、登记（检验前程序）
一、标本的采集
标本的采集是细胞病理学提高阳性检出率的关键，必须高度重视。
（一）标本采集原则
1.要正确选择标本采集的部位，尽可能直接在病变区获取样品，以提高正确率和阳性检出率。
2.采集方法应简便，使病人少受痛苦，且不致引起严重的并发症或促使肿瘤扩散。
3.用于细胞病理学检查的标本必须保持新鲜，防止细胞自溶或腐败。临床送检标本取材后应及时固定或预处理（如湿固定标本宜在取材后数秒内置于固定液中）或按要求尽快送达病理科细胞学实验室，以便验收无误后即刻进入检验处理程序。
4.送检标本力求有足够数量，以达到满足细胞学检查诊断的最低要求。标本应尽可能避免或减少血液、黏液等干扰物的混入。
5.采集工作根据不同的检测要求，可由临床医师和／或细胞病理学室专业人员独立或共同承担完成。
6.医务人员应向病人口头或书面说明检查的目的、方法和检查中可预测或不可预测的相关情况。必要时双方应签订检查相关知情同意书，以防不必要的医患纠纷。
7.特殊标本（如烈性传染病、艾滋病、梅毒、结核等）应按规定经特殊预处理后送检。
（二）标本采集方法
根据检查部位、检查项目和检查目的的不同，标本的采集方法各异，常用的标本采集方法有：
1.直视采集法。外阴、阴道、宫颈、鼻腔、鼻咽、口腔、肛管及皮肤等病变部位，可用刮片、擦拭、刷洗或吸管吸取物作细胞涂片；食管、胃、气管及支气管、膀胱等部位病灶可用内窥镜直接刷取物作细胞涂片。
2.自然分泌物采集法。包括痰液、尿液、前列腺分泌液、乳头溢液、浆膜腔积液等。
3.灌洗法。通过向与外界相通的空腔器官内或胸腹盆腔内或手术野灌注生理盐水等，运用冲洗、振动、揉捏等方法，使器官表面细胞脱落，然后将灌洗液取出，经处理后检查。
4.细针吸取法。此法是指采用外径≤0.8mm的细针头穿刺，吸取体表可触及肿块，或通过X射线、B超、CT等引导的深部脏器病变，吸取微小组织成分进行细胞形态学诊断，或其他相关细胞学技术研究。
5.摩擦法。此法主要采用摩擦工具，在摩擦病变区的黏膜表面直接涂片。常用的摩擦工具有网套、海绵摩擦器、气囊等。此法用于食管、胃等部位，目前已较少应用。
二、标本的验收
病理细胞学实验室应有专人负责临床细胞病理学标本及申请单的验收工作，并严格执行标本交接验收签名责任制。验收工作包括如下内容：
1.应认真核对每例送检标本和申请单，确保标本和申请单在患者姓名、送检科室或单位、送检标本内容物、送检日期及联号条码等方面的完全一致。发现疑问应及时与送检科室或临床医师联系，并将联系后的相关情况在申请单上备注。申请单中临床医师填写的重要项目原则上不得擅自改动，若必须修正应由送检科室临床医师签名确认。
2.认真检查存放送检标本容器是否完好，盛具是否洁净，容器上标本识别标签是否粘贴牢固，检测内容物是否完整、是否符合受检要求。
3.认真查阅申请单各项目是否按要求填写清楚。它包括：
（1）患者基本情况（姓名、性别、年龄，妇科应注明月经史、生育情况、是否放置宫内节育器等）；送检单位（医院、科室），床位，门诊号／住院号；送检日期；送检医师；送检标本类别及要求（痰、尿、胸腹腔积液、灌洗液、各种刷片、针吸标本涂片以及特殊检测要求如免疫组化、分子病理学检测等）；患者或家属的联系方式（地址、邮编及电话号码），以便必要时联系、随访。
（2）患者病史摘要（症状及体征、实验室／影像学等检查结果）、手术（包括内镜检查）所见、既往病理（细胞学）检查情况和临床诊断等。
4.对体液和分泌物标本，如痰液、尿液或胸水、腹水以及细针吸取细胞标本等应记录色泽、性状及数量等必要参考指标。
5.对不符上述规定的标本及申请单原则上应退回、不予存放。拒收标本应填写“标本退收通知书”退回临床送检人，或在标本送检本上作说明后退回，以便作为质量跟踪和整改的凭据。凡有下列情况者应拒收标本：
（1）申请单与相关标本未同时送检者；
（2）申请单填写内容与送检标本不符；
（3）标本及存放容器无患者姓名、科室等标志；
（4）申请单填写内容字迹潦草难以辨认或漏填重要项目；
（5）送检标本发生严重自溶、腐败影响诊断者。
6.特殊情况下，对某些送检不合格或不符要求的原始标本（例急诊危重病员标本、某些不稳定性或不可替代标本等），则可选择先处理标本，后由提供标本责任人补充相关的信息后再签发报告，并在报告中作出约定的关键备注或提示。
三、申请单、标本的编号、登记
1.验收标本人员应在标本验收同时在申请单上注明收到标本日期，并及时准确地进行细胞病理学标本的编号、登记工作，逐项完成登记簿书面编号登记或计算机输入登记，各检测项目可根据实际工作需要分类编号登记。
2.细胞病理学标本、申请单、涂片后的载玻片、标本登记本或计算机输入的编号必须完全一致，以便及时备查。
3.验收登记后标本应统一存放于规定的容器内或实验操作柜内待检，防止交叉污染或错号，做好室内交接班工作，以便及时进行下一检验流程的处理。
第二节 细胞病理学标本的制作（检验中程序）
一、标本的预处理
根据细胞病理学送检标本的取材部位、样本内容、检测目的的不同，通常需要进行细胞标本的预处理，主要包括下列五方面内容：
（一）血性标本预处理
（1）适用范围。血性胸水、腹水、尿液及液基巴氏标本。
（2）取液。血性送检液静置30min后，轻轻将送检液上部分倒掉，取下层液体至离心管。
（3）离心。第一次离心沉淀（2500～3000r／min，3～5min）。
（4）清洗。弃去上清液（若沉淀物呈红色且量很多，则应用吸管吸掉上清液，以免沉淀物一并倒出），取沉淀物上层细胞加入适量酒精冰醋酸液（5%～10%冰醋酸，25%酒精），置振荡仪上振荡（1500oct／min，10min）。
（5）离心。第二次离心沉淀（1000～1500r／min，5～7min），若沉淀物肉眼观察仍有较多血液，则重复清洗。
（6）制片。弃去上清液，吸取沉淀物制片。
（二）黏液性标本预处理
1.适用范围。痰液、支气管毛刷标本、液基细胞学标本。
2.取样。
（1）痰液。用棉签取痰杯中较稠的最好是带血丝的部分，约黄豆大小即可。
（2）支气管毛刷物。
（3）液基细胞学标本：离心沉淀（2500～3000r／min，3～5min），取沉淀物。
3.消化黏液。根据标本量及标本的黏稠程度向标本中加入1，4‐二硫苏糖醇（DTT）液（10～20ml的蒸馏水加1g的DTT冷藏保存）适量，置振荡仪上振荡（1500oct／min，10～30min）至肉眼未见黏液丝即可。
4.离心。第二次离心沉淀（1000～1500r／min，5～7min）。
5.制片。弃去上清液，吸取沉淀物制片。
（三）细胞量少标本预处理
适用于尿液、脑脊液、支气管灌洗液、腹腔冲洗液，采用多次重复离心沉淀原则。送检液静置30min后，轻轻倒去上层液体，剩余液体混匀后，倒入离心管中，进行第一次离心；弃去上清液，同一支离心管中再倒入送检液，第二次离心沉淀。视沉淀物多少决定有无必要继续取液离心沉淀，弃去上清液，吸取沉淀物制片。
（四）感染性标本预处理
1.适用范围。结核穿刺液、痰液及其他感染性标本。
2.甲醇液具有抗菌、抗病毒的效果，在15min内使88.88%以上的细菌和病毒灭活，包括：白色念珠菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、结核杆菌、痘病毒和艾滋病病毒。
3.2%聚乙二醇和50%乙醇混合液。
（五）标本的预固定处理
为便于样本的保存、传送，部分标本也可进行制片前预固定程序，如胸腹水、尿液等标本，可加入适量50%乙醇进行预固定处理等。
二、细胞病理学制片的基本要求
（一）涂片制作的原则要求
1.取材标本应新鲜，取后即刻固定并制片。
2.标本取样制片操作应规范、手工涂片应轻柔，防止挤压损伤细胞。
3.涂片要求细胞均匀，厚薄适度，太厚细胞重叠，影响镜下观察；太薄细胞过少，影响阳性检出率。根据不同的标本，可针对性采用不同的涂片方法，包括推片式、直线方向涂抹式、顺时针或撕拉式涂片、液基制片等。标本内容物应涂在载玻片右侧2／3范围内，留有标签粘贴空间。
4.标本制作所用载玻片、盖玻片应清洁、透明，载玻片必要时应事先采用硫酸洗涤液浸泡、冲洗，烘干备用。盖玻片应防止霉变等因素影响透明度。
5.对缺乏蛋白质的液体标本，在制片时亦应先在载玻片上涂抹粘附剂，以避免染色时细胞脱落。
6.特殊性标本，例如痰液、体液性标本、免疫组化、特异性或传染性标本，应按各自性质和要求分别处理制片（详见相关章节）。
（二）液基细胞学涂片的制作技术
液基细胞病理学（Liquid based Papanicolaousmear，LBP）制片技术是指采用薄层制片自动装置制备细胞学标本的一种新方法，是近年来在国内、外细胞学检查中被逐渐广泛应用的一种新技术。LBP制片技术首先将临床取得的细胞学样品保存在液基保存液中，然后再通过一定的技术方法将细胞薄层均匀地转移到玻片上，再进行染色镜检的方法。其主要优点在于：
（1）制片过程标准化，规范化；
（2）质量稳定，可重复制片；
（3）均匀薄层，细胞结构及背景清晰；
（4）便于进一步进行分子病理学及免疫学检测。
目前LBP主要应用于妇科细胞病理学检查，国内、外部分医院也应用于浆膜腔积液、痰液、尿液等细胞病理学常规检测。
1.根据液基制片产品的制片原理不同，目前在浙江省应用的LBP制片设备可分为以下种类。
（1）微孔膜过滤技术。代表性设备为ThinPrep液基薄层制片系统（简称TCT），由美国赛迪公司研制和生产。其主要原理是通过对液基样本过滤，有选择性地留取有价值的细胞成分制片，而减少无诊断意义的成分。其制片过程主要包括细胞分散、（随机）取样、过滤、转移等。该项技术获得美国FDA认证，与传统巴氏涂片相比，能进一步改善标本质量，更加有效提高低度及以上皮内病变的检出率。此类技术的核心是高精度程控过滤技术，关键内容包括过滤膜质量、自动化处理程序、随机化取样控制及细胞转移。目前类似原理的设备技术尚有赛立得等。
（2）离心分层沉淀制片技术。代表性设备是美国三路影像公司开发的Autocyte细胞制片仪。其主要制片原理是通过二次离心，即第一次密度梯度试剂加程控离心，分开并去除血液、黏液及大部分无诊断意义的炎症细胞，第二次离心集中细胞，再通过自然沉降制片。其产品也已通过美国FDA认证，检测结果与传统巴氏涂片相似。其制片不满意率有显着降低，此类技术的核心在于比重液。国内类似原理的产品设备技术尚有安必平等。
（3）离心沉淀制片技术。代表性设备是英国Thermo公司生产的Shandon Cytospin和Iversal公司生产的Liqui‐Prep（利普）等。严格地说此类技术在样本实际处理过程中没有对细胞及黏液、血液成分进行选择性提取，这与上述两类技术尚有区别。其制片原理是通过离心沉淀，与一般的浆膜腔积液处理类似，不过各个生产商在推出时增加了前期血液、黏液处理过程，制片过程采用了直接离心涂片或甩片制作等技术方法一步完成。
2.优质薄层液基细胞学涂片的基本要求
标本质量的满意度取决于正确掌握标本取材和制片染色的技术，而标本的取材质量是决定细胞病理学诊断正确性十分重要的初始环节。要求标本应有足够诊断的细胞数量及定点取样的合格率，其核心为取样的规范化，需要临床和细胞病理学专业人员的密切配合和协同。以妇科细胞病理学检查为例：
（1）优质薄层液基细胞学制片设备技术应具备以下条件及特点：
①产品应具有国家行政部门的审批注册，并依据相关法规符合准入标准，如宫颈细胞病理学检查取样设备应符合二类医疗器械管理要求。
②能选择性收集足量的供诊断用细胞，尽可能去除干扰诊断或无诊断意义的成分。
③标本能随机化取样，以保证诊断正确性和可重复性。
④制片过程尽可能自动化，以减少人为的干扰。
（2）优质薄层液基细胞学涂片的基本要求：
①液基制片的标本其涂片鳞状细胞数量通常要求达到20000个，以FN双目镜／40×物镜下统计，每个视野平均数量应在15～36个，至少应可观察（40×物镜下）计数10个视野（水平或垂直）。有资料显示，细胞数量增多可提高对高级别病变的检测率。