一、材料选择
1.材料:已染病毒的马铃薯块茎。
2.培养基:
(1)茎尖培养:MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.8mg/L+GA30.1mg/L+蔗糖2%,pH值5.8~6.0
(2)生根培养:MS
二、方法和步骤
1.在正常的温度和光照条件下,在土中种1块单芽眼块茎,当芽长到约15cm高时,将顶梢切下6cm~8cm长,去掉下面的2个叶片,在切口处涂上生根激素,植入1个内装消毒土壤的花盆中,保持湿度60%~70%。
2.植入花盆3周~4周后,将其移入人工气候培养箱中,光照强度240μmol·m-2·s-1~320μmol·m-2·s-1,光照时间每天16h,白天温度36℃,夜间33℃。
3.2周后打掉幼株的茎尖,以促进腋芽的生长。
4.经过总共6周的热处理之后,折下1个腋生枝以从其上取芽,在植株上至少留下2个叶片以促其进一步生长。由折下的腋生枝上剪去叶片,但要把一小段基部叶柄留在枝上,把这个腋生枝包在滤纸内以防枯萎。
以下各项皆须在无菌条件下进行。
5.在40×体视显微镜下,把茎尖解剖出来。剥取茎尖的方法是:把残留的叶柄向后拉,使芽暴露出来,然后用1根解剖针剥掉芽上的幼叶。这项操作必须迅速,以免超净台的气流风干茎尖。
6.当只剩下2个最幼小的叶原基时,用1把锋利的解剖刀切下茎尖(300μm~500μm),直立向上接种到培养基上。
7.培养条件:温度23℃,每天光照16h,光照强度80μmol·m-2·s-1。在有些品种中,经过1周~2周培养后,茎尖即开始变绿、伸长、基部变粗,1个月后,茎伸长明显,原来的叶原基发育成小叶片。这时若把它们转入生根培养基中,就会逐渐长出根系,最后形成完整的小植株。
8.当茎长到3cm或更长并已生根时,即可移入土壤。起初要把植株保持在高湿度的环境中。
9.移入土壤后,立即对植株进行第一次病毒检测。
【思考题】
1.马铃薯脱毒的意义和必要性。
2.热处理脱除马铃薯病毒的主要环境指标是什么?
3.描述茎尖剥离的操作方法。
4.茎尖培养的培养环境、条件和培养基是什么?