一、目的与要求
1.学习培养基配制与灭菌的操作方法。
2.通过学习，使学生能够独立地进行培养基配制和灭菌。
二、原理
培养基是外植体生长的物质基础，通常有两个水平，一是基本培养基，二是完全培养基。基本培养基如MS、White、Nitsch、N6、B5等，包含无机盐、维生素和氨基酸等。完全培养基是在基本培养基的基础上，根据不同试验要求，附加一些物质，如植物生长调解剂以及其他的有机附加物。在配制完全培养基时要严格按照配制程序和要求进行，尽可能减少人为造成的误差和避免人为造成的失误，如培养基支撑物琼脂的浓度和培养基的pH值过低或过高会导致培养基不凝固或过硬，培养基不能利用，需重新配制。
培养基中含有大量的有机物，特别是含糖量较高，是微生物繁殖的极好场所，而培养基是在有菌的环境中配制的，本身携带各种杂菌，因此，培养基配制完毕和分装后应及时灭菌，否则培养基中就会滋生杂菌，改变培养基的营养成分和pH值，影响培养效果。常用灭菌方法有采用高压蒸汽灭菌（高温湿热灭菌）。高压蒸汽灭菌的原理是利用高压饱和水蒸气实现灭菌。灭菌作用取决于温度，而不是直接取决于压力，高压是为了提高温度和缩短灭菌时间。在高压蒸汽灭菌锅中因为密闭使蒸汽压力上升，并因压力上升而使水的沸点升高。在1.06kg/cm2的压力下，温度达到121℃，可以很快杀死各种杂菌及它们的高度耐热芽孢，而这些芽孢在100℃的沸水中能存活几个小时。高压蒸汽灭菌具有被灭菌物品不易失水，时间短，应用普遍等特点，常用于培养基、无菌水、接种工具、滤器、空瓶等的灭菌。一些不耐热物质如ABA、ZT、AgNO3、抗生素等遇热容易分解，通常只能采用单独液体过滤灭菌。在超净工作台上将过滤的液体加入经过高压蒸汽灭菌的培养基中，在培养基冷却至45℃左右，琼脂凝固之前加入过滤液体。
三、材料、仪器、试剂
1.仪器和用具
高压蒸汽灭菌锅、电炉或微波炉、电子秤、搪瓷缸、培养皿、三角瓶、烧杯、量筒、移液管、玻璃棒、记号笔、pH试纸、封口膜、线绳、石棉网等。
2.试剂
培养基各种母液、蔗糖、琼脂、1mol/L盐酸；1mol/L氢氧化钠。
四、实验步骤
1.培养基配制分组进行，每组配制培养基1000mL。
（1）混合液量取：每组取500mL烧杯1个，用100mL量筒量取大量元素（20倍）50mL，分别用移液管吸取微量元素（100倍）10mL，铁盐（200倍）5mL，有机母液（100倍）10mL，植物生长调解剂（种类和浓度根据植物材料确定），置于烧杯中待用。在量取时移液管不能混用。
（2）培养基熬制：每组取1000mL的搪瓷缸1个，用量筒取500mL蒸馏水倒入烧杯中。称取6.0g琼脂粉倒入烧杯中，再称取30g蔗糖待用。将加入琼脂的烧杯放在石棉网的文火上煮沸，加热时不断用玻璃棒搅动，待琼脂溶化后加入蔗糖。蔗糖溶解后，将配好的大量元素、微量元素、铁盐、有机物以及植物生长调节剂的混合液倒入搪瓷缸中，然后将装混合液的烧杯用蒸馏水洗3次，倒入搪瓷缸中，用搪瓷缸与烧杯来回多倒几次，使其完全混匀，后加蒸馏水定容至刻度线。
（3）pH值调试：用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠将培养基pH值调至5.8。调pH值时应用玻璃棒不断搅动，用pH试纸测试pH值。
（4）培养基分装：将1000mL培养基分装于25只三角瓶中，每瓶约40mL。分装培养基时可利用玻璃漏斗或玻璃棒等将培养基注入三角瓶中，不可将培养基倒在三角瓶内外壁和瓶口上。
（5）封口绑扎：用封口膜或三层硫酸纸或牛皮纸封口，用线绳绑扎，用记号笔标注培养基代号，注意绑扎紧实。
2.培养基灭菌，应用高压蒸汽灭菌方法，以普通人工控制的高压灭菌锅为例。
（1）加水：将水加入高压灭菌锅的外层锅内，水位高度与支柱高度一致。连续灭菌时一定要检查水位高度，及时注水补充。检查水位是灭菌前的必须步骤，因为水量不足会导致高压灭菌锅的损坏。
（2）装锅：将分装的培养基和所需的各种用具放入高压灭菌锅的消毒筒内，不要过于紧密，三角瓶瓶口向上，盖好锅盖，上好螺丝。
（3）排气：在增压前应将锅内的冷空气排尽，使蒸汽能达到各个消毒部位，以保证彻底灭菌。排气有两种方法。一是加热前打开放气阀，加热后等到大量热蒸汽排出后再关闭放气阀；二是加热前关闭放气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时打开放气阀排出空气，再关闭放气阀。一般多采取第一种排气方法。
（4）灭菌：待压力上升到1.1kg/cm2时开始计时，压力上升到1.3kg/cm2时断电，等到压力下降到1.1kg/cm2时通电，上升到1.3kg/cm2时断电，如此反复几次，使压力在1.1kg/cm2～1.3kg/cm2之间维持20min，然后断电。注意严格遵守灭菌时间，时间短达不到灭菌效果，时间长会使一些化学物质遭到破坏，影响培养基成分。
（5）开锅：等到高压灭菌锅内的压力回到“0”时，方可打开放气阀，排出剩余蒸汽，再打开锅盖取出培养基。不要为急于取出培养基而打开放气阀排气，使压力降低太快，引起减压沸腾，使容器中的液体溢出。培养基灭菌后取出让其凝固，直立放置让其保持平面，有的试管为扩大培养面积，要求斜放保持斜面。
五、实验结果与分析
一般情况下，灭菌后凝固的培养基可以立即接种。为了观察灭菌结果，可以将灭菌后的培养基放到培养室中预培养3d，若无污染反应，则证明灭菌可靠，可以使用，若出现污染，应查找原因，另外配制培养基和灭菌。暂时不用的含有生长调节剂的培养基应放置于4℃～5℃条件下保存。含赤霉素或吲哚乙酸的培养基应在配制1周内用完。
【作业】
填写本项目实训报告单。