刚解决了啤酒变质问题，又一道科学难题横在了巴斯德面前。酒变酸是由于乳酸杆菌发酵的缘故，那么乳酸杆菌是从哪里来的呢？这很容易让人想到，是不是由酒液的非生命物质自然发生的。因此，自然发生说又复活起来，人们围绕着“微生物能不能自然生成”的未解之谜继续展开大论战。当时法国科学院特意成立了一个负责自然发生说的仲裁委员会，它的宗旨是“平息这场无休止的、最近又日趋激烈的争论”。
法国科学院还做出决定，凡是能用可以证实的精确实验阐明生物原始发生问题的人，将被授予奖金。结果，这项奖金被巴斯德获得了。
要驳倒自然发生说不是件容易的事，况且自然发生论者人多势众，其中不乏当时颇有名望的科学家，公众的舆论对巴斯德也很不利。
然而，巴斯德不愧是一个伟大的天才，他不仅有高超的实验技能，更难能可贵的是他严密的科学思维方法和逻辑推理能力。他设想，要是生物真能随时随地由非生命物质转化而来，那么，酒变质是不可避免的，因为即使把酒中的杂菌杀死，过后它们还会再长，所以要解决酒变酸的问题是不可能的。
但事实证明，经“巴斯德消毒法”处理后的酒只要妥善保管，就不会再变酸，这说明实际情况并不像自然发生论者所想像的那样。酒中的乳酸杆菌肯定是来自周围环境，极有可能来自空气。
如何证明空气中含有微生物呢？巴斯德做了这样一个实验：他把一团棉花放在水中煮沸，直到杀死棉花和水中的全部细菌乙然后，他把新鲜空气打入棉团，再将棉团放入原来的无菌水中立即观察，结果棉花和水中都有微生物生存和繁殖。
这似乎可以证明空气中含有微生物了。
可是，反对者横挑鼻子竖挑眼，硬说这些微生物不是来自空气，而是在无菌的棉团和水中自然生成的。
巴斯德又设计了一个实验：用一块无菌棉团过滤空气，然后迫使过滤后的空气穿过第二块无菌棉团，再将第二块棉团放入水中，结果发现，在水中没有微生物出现。为什么呢？惟一可能的解释是：第一块棉团阻截了空气中的微生物，使它们无法接触到第二块棉团或无菌水，所以第二块棉团和无菌水中没有微生物出现。这回自然发生论者该无话可说了。
巴斯德以其独具匠心的实验，证实了空气中含有微生物的结论。这无疑给自然发生说一记重锤。然而，自然发生论者仍然千方百计维护自己的学说。他们所持的一个普遍论点是：空气是产生生命必不可少的条件，隔绝了空气，生物就不能自然发生。无论取自何处的空气，都保证能产生出大量的微生物来。巴斯德深知，越是对方坚持的地方，也正是其脆弱的地方。
这一回，巴斯德又耗费了大量的精力，终于设计出了一个新的实验，一个非常著名的实验。他把肉汤灌进两个烧瓶里，第一个烧瓶就是普通的烧瓶，瓶口竖直向上；而将第二个烧瓶在火焰上熔化瓶颈，不是将它融合，而是把它拉长，弯曲成天鹅颈一样的曲颈瓶。然后把肉汤煮沸、冷却。两个烧瓶都没有用塞子塞住瓶口，而是敞开着，外界的空气可以畅通无阻地与肉汤表面接触。他将两个烧瓶放置一边。过了三天，第一个烧瓶里就出现了微生物，第二个烧瓶里却没有。他把第二个瓶子继续放下去：一个月、两个月，一年、两年……直至四年后，曲颈瓶里的肉汤仍然清澈透明，没有变质。这是为什么呢？
巴斯德解释说，因为第一个烧瓶是顶端开口，悬浮于空气中的尘埃和微生物，可以落入瓶颈直达液体，微生物在肉汤里得到充足的营养而生长发育，于是引起了肉汤的变质。第二个烧瓶虽然也与空气相通，但瓶颈拉长弯曲，空气中的尘埃和微生物仅仅落在弯曲的瓶颈上，而不会落入肉汤中生长繁殖引起腐败变质。
巴斯德以令人信服的实验赢得了舆论的一致支持，自然发生论者自知理亏，于1864年6月宣布退出这场辩论。这场旷日持久的大论战以自然发生说的失败而告结束了。