嘉靖四十二年（1563）八月十七日，朱翊钧出生在裕王府，是朱载垕的第三子。朱翊钧的诞生给裕王府带来欢乐，王府张灯结彩，来道贺的人络绎不绝，热闹非凡。然而，这种喜庆的气氛很快就烟消云散了，代之的是人人自危的恐怖现象。原来朱翊钧的祖父嘉靖皇帝，对于这个皇孙的出世并不高兴，而是产生一种愤恨的心理。因此，关于朱翊钧的诞生，没人敢报告皇帝，更不敢为之起名字。直到5岁时，这个皇孙才有了朱翊钧这个名字。
嘉靖皇帝晚年更加多疑，他怕裕王朱载垕威胁他的皇位，连过年过节都不准裕王去看他，更不用说平常问安了，这种不正常的父子关系给裕王的精神上带来很大不安，但是，朱载垕知道，中国传统的父死子继的法规是不能变的，也正是这一点支持着他，给他希望和安慰，让他安静地等待时机，因为嘉靖皇帝此时只有他这一个继承人了。如其所愿，1566年，嘉靖皇帝病逝，临终遗言的第一条就是让裕王朱载垕继位。同年，朱载垕即皇帝位，是为穆宗。朱翊钧令他的父皇喜欢。隆庆二年（1568）朱翊钧被立为太子，那时他刚刚6岁。有一天，父亲在宫中驰马，跑得很快，朱翊钧对父亲说：“陛下是天下之主，小心点，别摔着。”穆宗皇帝听了，高兴地跳下马来，把他抱在怀里，并给予赏赐。陈皇后有病另居别宫，朱翊钧每天都随母亲李贵妃去探望，陈皇后听到他的脚步就非常喜欢他，总是勉强爬起来出门迎接。皇后拿来经书考问他，朱翊钧总是对答如流，李氏也很高兴。由于他的关系，两宫相处十分融洽和睦。
隆庆六年，隆庆皇帝龙驭上宾。9岁的皇太子穿着丧服接见了臣僚。按照传统的“劝进”程式，全部官员以最恳切的辞藻请求皇太子即皇帝位。头两次的请求都被皇太子所拒绝因为父皇刚刚驾崩，自己的哀恸无法节制，哪里有心情去想到个人名位？到第三次，他才以群臣所说的应当以社稷为重作为理由，勉如所请。这一番推辞和接受的过程，有条不紊，有如经过预习既然登上皇帝的宝座，他就必须对各种礼仪照章办理。在同样庄严的仪式下，万历皇帝授予他的兄弟叔侄辈中的一些人以“王”的称号，封他们的妻子为“王妃”，批准他们子女的婚姻。而最隆重的仪式，却是把“仁圣皇太后”的尊号上赠给他的嫡母隆庆的皇后陈氏，把“慈圣皇太后”的尊号上赠给他的生母隆庆的皇贵妃李氏。
慈圣皇太后对万历皇帝有极大的影响，因为除了她，没有第二个人再能给他以真正的天性之爱。但是在万历登基以后，根据皇家的习俗，一种无形的距离就存在于太后和皇帝之间，使母子之间的天性交流变得极为不便。例如前此不久万历曾下令修尊装满慈圣所居住的宫室，竣工之后，她的感谢不是用亲切的口吻加以表达，而是请学士写成一篇文章，赞赏皇帝的纯孝，在他下跪时逐句诵读。这篇文章，因为能对全国臣民起表率和感化的作用，所以就成为本朝的重要文献。有时，万历用宫内的傀儡戏来讨取太后的欢心，在她下轿之前，他也必须跪在庭前恭候想驾。但是母爱毕竟是一种最深刻的感情，在多年之后，尽管万历皇帝临朝的机会越来越稀少，每当十一月慈圣的生辰，他却仍然亲临皇极门接受百官的庆贺。
也就是在此之前不久，万历册封他的爱妃郑氏为皇贵妃，并预先公市礼仪以便各有关衙门作必要的准备。消息传来，就有一位给事中上疏提出异议，其理由为：按照伦理和习惯，这种尊荣应该首先授予皇长子的母亲恭妃王氏，德妃郑氏仅为皇三子的母亲，后来居上，实在是本末颠倒。这一异议虽然引起万历的一时不快，但册封典礼仍按原计划进行。但谁也没有想到，这一小小的插曲，竟是一场影响深远的政治斗争的契机，导致了今后数十年皇帝与臣僚的对立，而且涉及到了整个帝国。
隆庆六年（1572）五月二十二日，宫中传出穆宗病危的消息。三天之后，即二十五日，内阁大学士高拱、张居正、高仪被召入宫中。高拱等人进入寝宫东偏室，见穆宗坐在御榻上，榻边帘后坐着皇后、皇贵妃，10岁的太子朱翊钧就立在御榻的右边。穆宗抓住高拱的手，临危托孤：“以天下累先生”，“事与冯保商榷而行。”接着，司礼监太监冯保宣读给太子朱翊钧的遗诏：“遗诏与皇太子。朕不豫，皇帝你做。一应礼仪自有该部题请而行。你要依三辅臣并司礼监辅导，进学修德，用贤使能，无事荒怠，保守帝业。”三辅臣即高拱、张居正、高仪三人。司礼监的地位也很重要，司礼监秉笔太监兼提督东厂冯保其实也在顾命之列。三位大学士受托之后，长号而出。第二天，隆庆皇帝即崩于乾清宫。六月初十，皇太子朱翊钧正式即位，改元万历。是为明神宗。
按照穆宗的布置，高拱是外庭的顾命大臣中排名最前的；在宫中，小皇帝自然还得依靠冯保。但是，冯保与高拱的关系非常恶劣。此前，司礼监几次掌印太监职位空缺，高拱先后推荐了陈洪、孟冲，就是不愿让冯保做掌印太监。冯保此人知书达理，又喜爱琴棋书画，很有涵养，所以很受穆宗的喜爱。冯保利用皇权更迭之间的权力真空，轻松地通过一道遗诏，就驱走了孟冲，自己做了掌印太监。但是，就高拱来说，对冯保自然是必欲除之而后快。在高拱的授意下，工科都给事中程文、吏科都给事中雒遵、礼科都给事中陆树德都开始弹劾冯保。由此，一场政治斗争势必不免。斗争中，冲突双方是冯保和高拱，而张居正表面上是帮助高拱的。但是，实际上，张居正与冯保关系非常密切，早就预谋赶走高拱了。
隆庆六年六月十六日，冯保就利用高拱曾经说过的“十岁太子如何治天下”一语把自视甚高、性格粗直的高拱赶离京城。高拱一走，高仪也惊得呕血三日而亡。三位内阁顾命大臣中只剩下张居正一人，担当辅弼小皇帝的重任。从此以后，万历朝的前10年，小皇帝的生活基本上是受三个人的规范：一个是自己的母亲慈圣李太后，一个是司礼监掌印太监冯保，一个是内阁大学士张居正。
神宗需要侍奉两位母亲。一位是嫡母仁圣皇太后，即原来穆宗的皇后陈氏；一位是生母慈圣皇太后李氏。仁圣皇太后体弱多病，不能生育，却很疼爱小皇帝。据说，小皇帝还是太子的时候，经常去皇后那里玩。陈氏每次听见太子跑的鞋声，就非常高兴。所以，神宗虽然尊崇自己的生母李氏，即改变过去皇帝生母只称“徽号加太后”的惯例，为李氏加“皇”字，称“慈圣皇太后”，但是，对于嫡母仁圣皇太后始终非常尊敬，一视同仁，备极孝心。当时人称神宗之孝顺，乃“古今帝王之孝所稀有也”。比起他的祖父世宗以宫廷逼仄的理由勒令孝宗张皇后迁居于宫城幽僻之地来，神宗显然是有情有义得多。不过，小皇帝的监护人主要还是生母慈圣皇太后。慈圣皇太后生性淳朴善良。例如，她虽然母以子贵，但是对于仁圣皇太后却非常恭敬。万历九年（1581）她为女儿寿阳公主选驸马的时候，面对侯拱宸等三位候选人，唯独选择了衣冠朴素、战战兢兢的侯拱宸，还说：“此子浑朴不雕，真我家儿也。”对于儿子，慈圣太后也一心想让他成为一个有为之君。据说，太后“教帝颇严”。每次万历小皇帝不读书，李太后就命令皇帝跪在地上。
要上朝的一天，五更时分太后就到皇帝睡觉的地方，叫他起来，命太监们把小皇帝扶起来，为他洗脸，催他上驾。有一次，小皇帝在宫中喝多了一点酒，命内侍唱歌。内侍回答说不会唱。小皇帝大怒，说内侍竟敢抗旨，拿起剑就刺，在左右的劝解下，小皇帝玩耍般地割了两个内侍的头发，算是将他们“斩首”了。这件事传到了慈圣皇太后的耳朵里。太后非常生气，命小皇帝在地上跪了很久，历数他的过错。小皇帝吓得涕泗横流，请求让他改正错误。这事才算了结。还有一次，皇帝在太监孙海、客用的引导下喝了酒，受二人的引诱将冯保的两名养子打伤，又骑马直奔冯保的住所。冯保被吓得只能抱起巨石撑住大门。第二天，冯保将此事禀告太后。慈圣皇太后立即换上青布衣服，不带首饰，命召阁、部大臣，要谒告太庙，将万历小皇帝废了。小皇帝吓坏了，赶紧前去请罪。太后说：“天下大器难道就是您可以继承的么？”意思是要改立神宗的弟弟潞王。神宗跪在地上哭了多时，皇太后才肯宽恕。