1个多月后，1919年5月4日，中国人民反对帝国主义和封建主义的伟大革命运动“五四运动”爆发了，中国现代史与中国新民主主义革命的序幕拉开了。这场运动正是从蔡元培领导的北京大学校园开始的。
原来，1918年11月，第一次世界大战结束了，侵略者德国战败投降。消息传来，蔡元培非常兴奋，心想，作为战胜国，中国可以收回被德国人侵占去的主权了。他早就等着这一天的到来了。
第二年1月，美、英、法、日等帝国主义国家在法国巴黎召开“和平会议”，讨论战后的有关问题。中国军阀政府在人民的压力下，向和会提出：希望帝国主义放弃在中国的特权，取消“二十一条”，收回中国山东的一切被日本夺去的权利。为配合中国的正当要求，蔡元培等人发起“国际联盟同志会”与“国民外交协会”，并致电出席巴黎和会的中国代表，要求他们维护国家领土的完整，把中国失去的权利要回来。
但是，蔡元培的希望落空了，全国人民的希望落空了。巴黎和会竟然拒绝了中国的合理要求，并且决定，把战败国德国在中国山东的一切权利不是还给中国，而是让给日本。就是说，中国虽属于战胜国，而待遇却同于战败国。消息传来，群情激奋，全国人民无不愤慨。1919年5月2日这天，蔡元培寝食难安。就在刚才，北洋政府外交委员会委员长江大燮来到他家，偷偷告诉他，北京政府国务总理钱能训已经秘密命令在巴黎的中国代表，答应帝国主义的无理要求，准备在条约上签字。经过考虑，他决定把真实情况告诉北大学生代表，并召集全校教职员大会，商讨挽救办法。当他把这一消息告知师生后，人群立刻炸开了。大家当即决定，5月3日晚上召开北京大学全体学生大会，同时邀请各兄弟大学的代表参加。第二天晚上7时，大会在北河沿法科大礼堂召开。一名学生当场把手指咬破，用血书写了“还我青岛”四个字。还有人拿刀要自杀，想以此唤醒并激励国人。群情激昂，非常感人。会议决定，5月4日在天安门举行示威。
5月4日，恰好是星期天，北京大学等学校的几千名师生愤怒地走上了街头。他们来到天安门前，举行集会，高呼口号：“外争国权，内惩国贼”、“取消二十一条”、“拒绝和约签字”。集会后，举行游行示威。北京政府的教育总长傅增湘急忙给蔡元培打电话，希望帮助制止学生游行。蔡元培当场表示：“学生爱国运动，我不忍制止。”结果，杨振声、江绍原、许德珩、潘淑等几十名学生遭到军警逮捕。蔡元培得知消息，立即设法营救。他对学生们说：“被捕同学的安全是我的事，一切由我负责。”当天晚上，师生们在大礼堂召开大会。蔡元培还请来法律专家王宠惠，共同商讨对付警察厅的法律手续问题。会后，蔡元培前往军阀段祺瑞最敬重的一位孙老前辈家中，请求孙老先生向段祺瑞说明当日学生的举动完全出自爱国，应该无条件释放。孙老先生在蔡元培的请求下，答应去试一试。又过一天，5月5日清晨，教育部命令蔡元培等各学校校长，把“闹事”的学生一律开除。下午2时，蔡元培与13所大专院校的校长在北大开会，当场表示，为使学生出监狱，他愿意“以一人抵罪”。接着，他便率领校长代表团前往警察厅和教育部，又去国务院及总统府，强烈要求：立即释放被捕学生，他愿意以身家性命作担保。6日，蔡元培又为营救学生奔波了一天。5月7日，被捕学生终于得到释放，蔡元培亲自率领北京大学全体教职员工前去迎接，并且发表讲话，给学生们安慰和勉励。
北京的行动轰动了全国，也传播到海外。天津、上海、长沙、广州等地的学生纷纷举行游行示威，声援北京同学。日本、法国等国的中国留学生以及南洋的华侨学生也开展了爱国活动。反动派害怕了，他们也更加憎恨蔡元培。
本来，人们对“蔡林之争”还记忆犹新，现在又由他做校长的北京大学引发了五四运动，蔡元培益发受到各种反动势力的集中攻击。他们质问：北京大学学生“闹事”，你做校长的该负什么责任？他们追根溯源，发现蔡元培就是引发学生运动的“罪魁祸首”，必欲除之而后快，甚至谣传要暗杀他。警备司令段芝贵说：“宁可十年不要学校，不可一日容此学风。”国务总理钱能训则斥责教育总长傅增湘：“你说蔡元培的校长地位不可动摇，那他死掉又当如何？”还有谣言说军阀们要烧校舍，杀学生，在景山架炮准备轰击。为了不给反动势力留下把柄，保护学校和学生，蔡元培决定辞职出走。
5月9日清晨，蔡元培剃掉长胡子，悄然离开北京，到达天津，准备第二天乘车去上海。南下途中，他给北京大学的同学们写了一封信，深情地说：我深信同学们的举动“纯出于爱国之热诚”。尔后，他曾经多次谈到五四运动，认为“一般青年学生，抱着一种空前的奋斗精神，牺牲他们可宝贵的光阴，忍受多少的痛苦，作种种觉醒国人的工夫”，理应在政治上给予充分肯定。
师生们听说敬爱的蔡校长要辞职，全都舍不得。为此，他们特意组织了“挽留蔡校长”运动，与政府当局严正交涉，坚决拒绝新任校长到校。这一行动，很快得到北京各学校师生及社会各界的响应与支持。反动政府的司法总长朱深在一次秘密会议上不禁感慨地说：“诸君不可视蔡元培为一书生，当视为十万雄师。吾人不可不以全副武装对付。”他们收买了20几个内奸，在北大法科秘密开会，想冒用全体同学的名义，通电欢迎新校长胡仁源，把蔡元培赶走。没想到，他们的阴谋被当场识破，其中5人被学生们抓了起来。但是，他们不甘心失败，又到法院起诉，状告北大学生滥抓无辜。结果，有11位学生因此被关进监狱，准备判刑。蔡元培急忙给熟人写信，请他们帮忙斡旋，以免学生吃亏。给过反复斗争，最后，当局不得不作出让步，取消新校长的任命，挽留蔡元培。9月，蔡元培又回到北京大学，直到1923年初才离开。