男孩死后24小时，巴斯德把从死孩口中取出的唾沫加水稀释，然后分别注射到五只兔子的体中观察，不久，这些兔子都得了狂犬病死去。巴斯德又从这些死兔的口中取出唾沫，加水稀释后再注射到其它兔子的体内，这些兔子也都死了。
看来，唾沫中可能就有引起狂犬病的病原菌，巴斯德用显微镜反复观察，却怎么也找不到病原菌。
“找不到病原菌，并不能认为就是没有病原菌。……肯定是有的。找不到病原菌，就不能征服狂犬病！”巴斯德静静地思索着。
巴斯德的助手鲁沃是个医生，他从医生的角度对狂犬病做了仔细的观察，发现不论是狗还是兔子或是人，只要得上狂犬病都要发生痉挛，不能吃东西，症状完全一样。经解剖观察，知道了狂犬病主要是影响神经，当影响到脊髓后，就要出现神经麻痹而死亡。
于是，他提出一系列的设想：病原菌既然在病体的各个部位都找不到，肯定是在脑髓或脊髓中繁殖，如果用病体的脑髓接触健康狗的神经，狗一定会发病。如果把带菌的水注射到健康狗的脑髓里，就—定会更快发病的。于是，鲁沃向巴斯德提议说：
“先生，我们在狗的头盖骨上开一个洞，从这里对脑髓进行注射观察如何？”
“不，这种方法太残酷了，在头盖骨上开洞，容易破坏脑髓，造成死亡。”巴斯德不以为然地回答。
就外科手术来说，在头盖骨上打洞并不是困难的大手术，这一点鲁沃是清楚的。鲁沃趁巴斯德外出的时候，在一只健康的狗的头盖骨上开了一个洞，把带菌的水注入狗脑中。
当巴斯德回来后，鲁沃向他报告了事情的经过。
“唉，太残酷了，可能已经死了吧？”巴斯德说。
这时，那只头上开过洞并绑着绷带的狗从门外跑了进来，在巴斯德周围欢快地摆动着尾巴。巴斯德摸摸狗的头部说：
“可怜的小家伙！”
这只狗终于在第十四天发病，于第十九天死去了。继续用同样的方法对十只兔子进行实验后，情况完全一样，实验证明了眼睛看不见的狂犬病的病原菌是在狗的脑髓里。
他们想把过去培养鸡霍乱疫苗的办法应用到培养狂犬病的病原菌上来。这是一件复杂的工作，他们虽然绞尽了脑汁，但不论怎样实验，制造出来的疫苗都是毒性不减。
毒性不减怎么能用于试验注射呢？巴斯德和他的助手们都很焦急，但是又没有更好的办法。
一天，巴斯德在庭院中一边散步，一边想着对策，突然，他想出了一个方案，急忙回到研究室。
他首先摘下一个因狂犬病刚死的狗的脑脊髓，把它切成了小块块，装到玻璃瓶中密封起来，把它和外部隔绝，以防浸进其它细菌。放在摄氏二十度左右的地方进行干燥。
24小时后的第一天，巴斯德取出一点点给一只狗做了实验性的注射；48小时后的第二天，又取出一点点给另一只狗进行注射……如此这般继续下去，两个星期后，也就是第十四天的时候，那只第一天注射的狗开始发病，接着每天都按着注射的顺序一只接着一只地发病，不久，又一只接着一只地死去了。
在他们实验的小屋子里，每天都有一只实验的狗死去。
说也奇怪。一天早晨，当助手到小屋来检查时，却发现有的狗没有发病，同时，发病的狗也没有死去。
第二天也是这样，这是一个可喜的迹象。
“先生，发病的狗没有死。”助手把情况报告了巴斯德。
“好，我们的实验收到了效果。这是哪天注射的狗啊？ ”
“经过第十四天以后的干燥物所注射的狗都没有死。”
“太好了，我们现在再进行一次比较有把握的实验。从今天开始，在剩下的两只狗身上，先用经过第十三天的干燥物。再用经过第十二天的、第十一天的干燥物，以逐步加强毒性进行实验观察。”
于是，一天一天注射下去，到了第十四天药已用完了，按一般情况两只狗都应该发病，但是这两只狗都没有发病。第一步取得了成功。
他们又把这两只狗移到患狗一起，进行另一次实验，这两只狗既没有发病又没有死亡。他们又从兽医那里找来没有进行过预防注射的两只狗，连同这两只经过多次实验的狗放到病狗一起做第三次实验。四只狗都被患病的狗咬过，那两只没经过预防注射的狗死了，而经过预防注射的两只狗却安然无恙。
实验证明是成功了。巴斯德和他的助手为此已经奋斗了三年了。这时已是1881年了。