李光耀对马来西亚当局的态度产生了深深的疑虑。这一疑虑在他的1965年新年献词中得到了充分的反映。他指出：“1964年这一年对我们来说，是马来西亚动荡不安的一年。大山脚和新加坡的种族骚动，沙巴的危机，易货贸易的停止，这一年以对一项不愉快的预算做了一次无聊的发言而结束了。但国家还在持续活动，人民总的说来没有气馁。然而，如果我们在1965年开始再做1964年做过的一切蠢事，那么马来西亚就会不是因为外来侵略而是由于内部分裂而可能彻底垮掉。不认识这一点是愚蠢的……未来的一年，我们必须决心制止这种走向毁灭的趋势，决心排除产生不能容忍的气氛，决心揭露这些种族集团主义分子、孤立极端主义者，决心从我们思想上驱除恐惧和仇恨，使人民对前途和彼此之间的良好意向有信心。”
然而，愿望仅仅是愿望。吉隆坡与新加坡之间的关系却日渐恶化。不过，为了力促新加坡经济的发展，争取更多的国际支持，李光耀不顾国内日益恶化的局势，继续外出访问，在外交上取得了重大成果。澳大利亚《悉尼晨报》把李光耀说成是“堪称全东南亚最有才干的政治人物，机敏、强韧，是一个极度现实主义者”。
4月25日，马来西亚国内的局势已经发展到令李光耀无法忍耐的地步，他感到是直接说话的时候了。他用福建话对他的支持者说：“问题的核心不是中央政府与新加坡政府之间的分歧，也并不是两个政府之间的行政困难，而是在一些根本问题上，这就是马来西亚各族之间的关系和一个马来西亚人的马来西亚的长远目标。”李光耀尖锐地指出：“马来西亚的某些政治领导人仍然相信，在马来西亚，一个种族能在政治上统治其他种族，这些领导人则能够通过获得这一特殊种族的支持而继续当权。”
5月初，李光耀不顾国内的紧张状态，出席了在孟买召开的亚洲社会党领导人会议。27日，李光耀在马来西亚议会听取国家元首穆阿扎姆·沙阿所做的演讲后，当即发表讲话：“当陛下发表演说时，《马来先锋报》正在印行一篇故事，标题为‘李光耀是东南亚人民之敌’。据《马来先锋报》报道，雪兰莪州务大臣拿督哈龙曾把李光耀说成是马来西亚人民的敌人，正在危及马来西亚的和平。《每日消息》同日报道，霹雳州务大臣号召马来人注意：‘李光耀不仅仅是我们的敌人，他还是对马来西亚安全最危险的威胁。’作为一名议员，我曾宣誓真诚效忠马来西亚，保卫和维护宪法。我不知道，我和我的同事究竟做了些什么，要被斥责为‘人民的敌人’？”“我仍然拥护宪法。我担心的是陛下演说中的暗示，即民主将告终，宪法可能会暂时停止执行或搁置于一边。”
国家元首无言以对，阴沉着脸默不作声。
随后，马来民族统一机构秘书长阿尔巴尔发表讲话，他在讲话中再次要求马来人联合起来，并永远不要忘记自己是马来人。
李光耀当即质问道：“这都是为什么？我认为宪法说我们都是马来西亚人，我不可能是马来人。假如我们真正的年富力强的华人站立起来，并高喊‘华人联合起来’，那么，在5年或10年内就会发生真正的麻烦。因为，500万华人占人口的42%！”
1965年5月，人民行动党同马来西亚的所有反对党联合成立了“马来西亚团结总机构”。6月6日，来自马来亚、新加坡、沙巴和沙捞越的代表，在新加坡国家剧场成功地召开了一次马来西亚团结会议，发起一场“马来西亚人的马来西亚运动”，反对中央政府的种族歧视政策。人民行动党在整个马来半岛开展活动，获得越来越多的支持。李光耀一派还在宪制、和平等问题上抨击中央政府。1965年7月，人民行动党又在马六甲、芙蓉镇、吉隆坡等地举行一系列群众大会，把为数众多的群众争取过来。
马来西亚当局当然不能无视人民行动党在整个马来西亚如此活跃，他们担心长期下去，人民行动党将成为马来西亚最大的政党，将主宰整个马来西亚，把马来半岛变成华人的天下。于是，吉隆坡的极端主义者决定阻止李光耀这样干下去，但是，他们又没有足够的证据足以授权逮捕李光耀。
吉隆坡处于进退两难之中，猜忌和恐惧使他们决定，把新加坡逐出马来西亚。
据《海峡时报》报道说，拉赫曼当时是马来西亚总理，他原来和李光耀过从甚密，李光耀也极力同他搞好关系。但是，由于对待马来西亚国策上意见的分歧，两人的关系日趋紧张。在拉赫曼看来，李光耀是个野心勃勃、非常危险的人物，而且又极难对付。6月25日，拉赫曼在伦敦医务所治疗带状疱疹，他躺在床上反复思忖，于7月29日决定把新加坡排除出马来西亚。拉赫曼认为除此之外别无更好的解决办法。
当时，拉赫曼及马来西亚的一些统治者认为，这是把李光耀等人置于死地，是制服李光耀及其人民行动党的一招妙棋。的确，新加坡对马来西亚的依赖性很大，连水都要靠马来西亚供应，脱离马来西亚，新加坡一天也难以生存。拉赫曼的如意算盘是通过这一招教训李光耀及其追随者，然后再让他们按照马来西亚当局的条件乖乖地屈服。毕竟新加坡有优良的港口，如果真的分离出去了，对马来西亚也是重大的损失。
在越来越紧张的气氛中，人民统一党领导人王永元莫名其妙地宣称，将辞去新加坡议会中的职务，并“决定永不过问政治”，反政府势力利用这一事件大做文章，企图摧毁李光耀政府。
李光耀处于四面楚歌之中。有人说，李光耀一生只当众哭过两次，一次是他母亲逝世时，另一次就是宣布新马分家时。的确，李光耀是极不情愿新加坡脱离马来西亚的。1963年以前，他多次唇焦舌敝地劝说新加坡人同意新马合并的主张，费了太多的精力才按照他的理想建成了新的马来西亚，可还不到两年，就被人一脚踢开，其委屈悲愤的心情是可以想象的。
1965年7月底，马来西亚代总理拉扎克与财政部部长陈修信突然访问新加坡，想探知他们压服新加坡的试验所取得的效果，看看李光耀能否做点妥协。然而，他们的满怀希望落空了，他们看到的是“李光耀那倔强的毫无妥协余地的信念”。
拉赫曼亲王8月5日回到马来西亚。8月9日，拉赫曼在马来西亚议会中郑重发表声明：“我在欧洲恢复健康期间，曾经彻底想过新加坡问题，并得出结论，唯一的答案在于答应李光耀先生的要求——出任独立的新加坡总理。现在，他就会承担在新加坡维持和平与安定的责任。我们对他表示良好的祝愿，并将继续协助他，在任何可能的时候同他合作。”
同一天，李光耀在新加坡市政厅宣布新马谈判破裂，正式分家。他说：“鉴于自由和独立是人民不可剥夺的权利，现在，我，李光耀，新加坡总理，于此代表新加坡人民和政府宣布并声明：从今天，本年8月的第9日开始，新加坡将永远是一个建立在自由与正义的原则基础上的民主、独立的主权国家，并在一个更公正、更平等的社会里，永恒地谋求人民的安宁和幸福。”
当时的《海峡时报》曾这样描述了李光耀宣布这件事时的表情：“他（指李光耀）带泪宣布……然后停顿下来，简直是不能自持……然后他继续说下去，再次不支，把头埋在双手之间。他说永远记住此一时刻，他说他对此事感到非常愤怒……他还说，他心如刀割，因为他半生为之奋斗的理想破灭了……”
拉赫曼决定新马分离，在马来西亚内部也引起了强烈的反对。马来民族统一机构秘书长阿尔巴尔虽然曾竭力煽动极端主义情绪，抨击李光耀，但他却不同意新马分离。当拉赫曼正式宣布这一决定时，这位致力于马来民族统一的秘书长愤然辞职。
脱离了马来西亚后，新加坡实现了完全独立，受到国际社会广泛的同情和支持。9月21日，新加坡共和国成为联合国成员国之一；10月，新加坡被接纳为英联邦第22个成员国；临近年终，印度尼西亚外长苏班德里约博士建议同新加坡谈判，消除双边对抗，新加坡对印度尼西亚这一建议表示欢迎，两国重归于好。
1966年1月，在红山区举办的第一次议会补选中，人民行动党获得了80%的选票，比1963年1月在该区得到的38.7%多了41.3%。到1967年3月，在汤申区补选中，得票率也从1963年的39%升至80.9%。可以说，人民行动党没有因新马分家而被压垮，相反，它挺了过来。对此，李光耀后来曾说过：“我们是绝不肯爬着乞求回到马来西亚的。”
新马分离，是李光耀一生的憾事。他从总理位上卸任后，《联合早报》记者曾这样问他：“李资政，回首你几十年的从政经验，你认为最满意的事是什么，而引以为憾的一件事又是什么？”
李光耀这样回答《联合早报》的记者：“看到今天的新加坡被治理得很好，也运作得很好，并且能够让每个人在生活中享有机会，这点给我的满足感很大。令我感到最大失望的是我们没有办法在马来西亚，在更具规模的层面上取得成功，否则的话，对每个人都会更好。”
创造经济奇迹
从马来西亚分离出来后，李光耀决定全面加强经济建设。1965年底，李光耀在新加坡议会所做的政府工作报告中指出：“我们将集中两项任务：第一，同那些与我们利益一致而关系又密切的国家加强联系，以扩大对外贸易，并为我们的工业建立可靠的市场；第二，推进健康的、稳定的和可预测的政治形势，为新加坡工业迅速增长创造先决条件。”
当时，美联社记者约翰·坎特韦尔采访李光耀时询问他的抱负，李光耀毫不犹豫地回答说：“我的个人志向是要让像我这样的人，以及他们的子孙和我的子孙，在这个国家有发展前途。我的根在新加坡，我们家族到新加坡生活已有了3代，近100年，我没有其他可以效忠的东西，我没有其他的祖国。我希望创造一种能够保证像我这样一些人的前途的局面。”
李光耀从来都对自己的政府和人民充满了信心，他曾经这样回答记者说：“我们小国家，却有大志气。我们新加坡虽然小，但大家立志要努力建成世界上经济最发达的国家之一。”
为了建立一个忠于人民的、有效率的政府机构，1965年10月26日，在新加坡脱离马来西亚两个半月时，李光耀以“不容公务员偷懒取巧”为题，在维多利亚剧院向高级公务员发表讲话，强调高效率公务员对建国的重要性，并表示要每一个“按钮”都能操作，而只有工作表现好的人才能擢升。
李光耀认为：“新加坡要生存，唯一的办法是‘刻苦干练’四字。世界上有好些国家，其中瑞士是个好例子，它的土地不多，多元种族，多种语言，可是其出产的纺织品却可以跟英国兰开夏的任何产品相媲美；瑞士出产的药品赶得上美国的任何货色！瑞士只靠人才、计划和努力来生存。我绝不怀疑，只要有计划、有胆识、有才干以及不断奋斗，就能有收获和报酬，这个地方就一定向前迈进，繁荣发达。”“我在8月9日之所以悲伤，不是为了新加坡，而是为了那些我们不得不把他们留在后头（马来西亚）的人们。因为现在我们不能帮助他们，而我们必定会向前进展，每年彼此的距离会更大——在生活水平上、经济发展上或工作表现上。”“但有两件事我将坚持我的立场，那就是：公平合理的工资，公平合理的工作。但如果工资是合理公平的，而你偷懒取巧，我将会对你不客气。为了全体新加坡人民的生存、前途，我必须这样。”“目前，我要到处奔跑，我所管理的不仅是自己的部门，因此，在我的汽车里装了一个电话。每天早上，司机受命要试打那个电话，看它行不行。我要它时时都没有毛病，谁拿起来都随时可以应用，绝不会有毛病。我要这个政府能够做到这一步。”“我们不要看到有人懒懒散散！”“我也要那些以为加入了政府部门服务，就会自动逐步晋级的人，忘记这回事。我们这个政府再也不是那样的政府。只有那些精力充沛、刚毅、富有才华、准备全心全意以工作表现争取进取的人，才能够获得晋升。至于那些偷懒和糟糕的人，尤其是那些本来有能力的人，却以为他们已考试及格，有了一个好学位，而且也已经通过了公共服务委员会这一关，于是就此坐享太平，扬扬自得，坐着不动，懒得用功，一味等着时间，以为早晚必会晋升为一个部门的首长，我要告诉他们：别再这样梦想，因为，公务员服务条例将要修改了。”
在这篇讲话里，李光耀并没有说大话，后来的事实说明，李光耀说的全是实实在在的话。李光耀在1990年辞去总理职务，新加坡人均国民生产总值为12603美元，马来西亚只有2283美元，新加坡整整是马来西亚的5.5倍。
1966年1月21日，是中国农历正月初一。在这个华人传统的喜庆节日里，李光耀总理在电视上微笑着向新加坡人民祝福。他高兴地对全国人民说：“这是我们自己作为主人而庆祝的第一个中国新年，这是值得我们欢欣鼓舞的。”
而作为一个致力于种族共存的领袖，李光耀在这之前已向马来人的穆斯林开斋节发表了节日祝词，祝他们节日快乐、幸福，并提示他们说：在独立的新加坡，人人皆为兄弟。