4Naomenko及Feigin小胶质细胞石蜡切片染色方法适用于常规石蜡切片，方法快速简单，结果优良。
试剂配制：20％硝酸银25ml5％碳酸钠200ml
两液混合逐滴加浓氨水至沉淀溶解近乎变清，稍呈轻微的云雾状为宜，临用前以双层滤纸过滤，滤液避免用手接触，以防污染。
染色方法：
（1）石蜡包埋切片20μm。
（2）切片脱蜡至水。
（3）3％盐酸水溶液1小时。
（4）蒸馏水迅速洗2次。
（5）5％碳酸钠水溶液2小时。以下步骤每张切片单独进行。
（6）浸碳酸银液1分钟。
（7）不水洗，移入0.2％甲醛溶液更换一次共10秒，至切片呈灰棕色。
（8）蒸馏水洗。
（9）5％次亚硫酸钠1分钟。
（10）水洗，脱水，透明，封固。
结果：小胶质细胞呈黑色。背景为灰色。
（四）神经内分泌细胞染色方法
1亲银反应
（1）LillieMasson 二胺银反应法
试剂配制：
①二胺银液：取28％氢氧化铵2ml，一滴滴加入5％硝酸银水溶液40ml中。先可稍快，后再放慢，间歇滴加，并不断摇荡，在溶液呈恒定的轻微混浊状态时停止。
②氯化金水溶液：1％氯化金水溶液2ml，硫氰酸铵2g，硫代硫酸钠3g，蒸馏水98ml。
染色步骤：
①中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
②蒸馏水洗2次。
③将切片浸入盛有二胺银液的染色缸中5～8小时。
④蒸馏水浸洗2次。
⑤氯化金水溶液1分钟。
⑥蒸馏水洗2次。
⑦核固红染色液5分钟，蒸馏水洗2次。
⑧无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：亲银颗粒细胞呈黑色，细胞核呈红色，背景为淡灰黄色。
注意事项：
①此法需用浸染法，也可用于冰冻切片进行染色。
②浓氨水内滴加硝酸银液，边滴边溶解，不断摇动由溶解较慢至不溶时，呈现恒定的微混浊状态为止。
③使用的所有玻璃器皿，必须洗干净，在浸染二胺银前后要用蒸馏水将组织切片洗净。染色时最好用对照片进行染色，在高倍镜下观察结果。
（2）Gomori－Burtner六胺银法
试剂配制：
①六次甲基四胺硝酸银原液：六次甲基四胺3g，蒸馏水100ml，5％硝酸银水溶液5ml。
②六胺银应用液：六胺银原液30ml，Holmes 缓冲液（pH 7.8，0.2mol／L 硼酸16ml，加0.05mol／L 硼砂液8ml）。
③Weigert碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水100ml。
④番红花红染色液：番红花红0.1g，0.1％醋酸水溶液100ml。
染色步骤：
①中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
②放入Weigert碘液10分钟。
③用5％硫代硫酸钠水溶液漂白2分钟。
④流水洗2分钟，蒸馏水洗2次。
⑤将切片浸入六胺银应用液（在恒温箱内预热60℃）2～3小时。
⑥蒸馏水洗2次。
⑦0.1％氯化金液2分钟，蒸馏水洗2次。
⑧用0.1％番红花红液内复染5分钟。
⑨用丙酮液脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：亲银细胞呈黑色，背景呈淡红色。
注意事项：
①六胺银应用液的浸染时间须严格控制，浸染2小时，经蒸馏水洗后，在显微镜下观察。
②细胞核复染可用核固红液染色5分钟，再用马休黄染色液增色3秒，直接用丙酮脱水。
2嗜银反应
（1）DeGrandi改良硝酸银反应法（1970年）
试剂配制：
①硝酸银液：1％硝酸银水溶液5ml，0.2mol／L 醋酸钠缓冲液（pH 为5.6）10ml，重蒸馏水85ml。
②还原液：对苯二酚1g，亚硫酸纳5g，蒸馏水100ml。
染色步骤：
①15％中性甲醛液或Bouin 液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
②蒸馏水洗3次。
③入硝酸银液内3小时，60℃温箱内。
④不经水洗，直接放入还原液置45℃恒温箱内1分钟。
⑤蒸馏水洗2次。
⑥入硫代硫酸钠水溶液内处理2分钟。
⑦蒸馏水洗2次，核固红液复染5分钟，蒸馏水洗2次。
⑧无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：嗜银细胞颗粒呈棕黑色，胞核呈红色。
注意事项：
①1％硝酸银水溶液要放入冰箱内保存，临用时与醋酸钠缓冲液混合后即可使用。
②硝酸银浸染2小时，再入还原液后，经蒸馏水洗2次，可先在镜下观察结果。
（2）碱性重氮反应法本法是显示小肠和类癌的嗜银细胞颗粒的较好方法。
试剂配制：
①坚牢红B 盐醋酸缓冲液：1％坚牢红B 盐5ml，0.1ml／L 巴比妥醋酸盐缓冲液（pH 为9.2）50ml。
②坚牢红B 盐碳酸锂饱和液：1％坚牢红B 盐5ml，碳酸锂饱和水溶液2ml。
染色步骤：
①中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
②入坚牢红B 盐醋酸缓冲液（预先将溶液置4℃冰箱内）5分钟左右。
③自来水冲洗2分钟。
④明矾苏木素液染色3分钟。
⑤自来水洗2分钟。
⑥用0.5％盐酸乙醇分化数秒钟。
⑦用自来水洗5分钟（返蓝）。
⑧无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：嗜银细胞颗粒呈橘红色至红色，细胞核呈蓝色，胞浆呈黄色。
注意事项：
①也可用坚固红B 盐碳酸锂饱和水溶液染色5分钟。
②本法染色的色彩比较好，要及时显微镜照相，防止存放褪色。十五、嗜铬细胞染色方法（一）Giemsa改良染色法试剂配制：Giemsa稀释液：Giemsa原液30滴，蒸馏水30ml。
染色步骤：
（1）Regaud 液、Muller液、Orth 液和Zenker液固定均可，石蜡切片，常规脱蜡至水。
（2）蒸馏水充分洗涤20～30分钟。
（3）浸入Giemsa稀释液内18～24小时。
（4）蒸馏水稍洗，再用吸水纸将切片吸干。
（5）迅速用丙酮脱水，丙酮二甲苯等量混合液快速冲洗。
（6）二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：嗜碱细胞呈红色至紫红色，皮质细胞呈蓝色，红细胞呈粉红色。
（二）Wiesel染色
试剂配制：
（1）甲苯胺蓝液：甲苯胺蓝1g，蒸馏水100ml。
（2）藏红花液：藏红花1g，蒸馏水100ml。
染色步骤：
（1）Regaud液，置于4℃冰箱内低温固定2～4日，移入3％重铬酸钾水溶液，于室温固定8～12小时，用流水冲洗6小时，石蜡切片，常规脱蜡至水。
（2）蒸馏水洗2次。
（3）甲苯胺蓝液染色20分钟。
（4）水洗后，用藏红花液染色15～20分钟。
（5）蒸馏水洗，再用95％乙醇迅速分化1～2秒。
（6）立即用无水乙醇快速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
结果：嗜铬细胞浆呈黄绿色，细胞核呈红色，其他组织均染成蓝色。
十六、脂肪染色方法
主要方法是苏丹Ⅳ／苏丹Ⅲ／苏丹Ⅱ法。
试剂配制：
（1）苏丹Ⅳ（苏丹Ⅲ、苏丹Ⅱ）染液：
苏丹Ⅳ（苏丹Ⅲ、苏丹Ⅱ）0.5g丙酮50ml 70％乙醇50ml（2）Mayer苏木精液：
A 液：苏木精2g无水乙醇40ml B 液：硫酸铝钾100g蒸馏水600ml 将苏木精溶于无水乙醇中（A 液），稍加热，使硫酸铝钾溶于蒸馏水中（B 液）。将A 液与B 液混合后煮沸2分钟，再用蒸馏水补足至600ml，加入400mg碘化钠充分混匀。染色呈紫色。
染色步骤：
（1）冷冻切片，厚6～10μm，如为新鲜组织，须用40％中性甲醛液固定10分钟，稍水洗后，用60％乙醇稍洗。
（2）苏丹Ⅳ（苏丹Ⅲ、苏丹Ⅱ）染液浸染1～2分钟。
（3）70％乙醇稍洗去多余染液。
（4）流水稍洗。
（5）Mayer 苏木精液复染胞核，必要时用1％盐酸-乙醇分化。
（6）水洗10分钟，或于稀碳酸锂水溶液中促蓝。
（7）阿拉伯糖胶或甘油明胶封盖。
染色结果：中性脂肪呈猩红色（用苏丹Ⅳ染色）、橙红色（苏丹Ⅲ）或橙黄色至橙红色（苏丹Ⅱ），细胞核呈蓝色。
电镜技术
（一）常规透射电镜标本制备技术
1.超薄切片制备技术
（1）固定：用pH7.2～7.3的2％～4％戊二醛磷酸钠缓冲固定液（分子渗透压在380mmol左右），将组织进行浸泡固定。固定的同时细切成1mm3大小组织块，在0～4℃的低温下，浸泡30～90分钟为佳。也可通过血管灌注，将1％～2％戊二醛灌注到需要固定的组织器官内。
（2）漂洗：用0.1mol／L 磷酸缓冲液漂洗1小时或过夜，温度4℃，其间换液3次。
（3）四氧化锇后固定：用1％四氧化锇磷酸缓冲固定液，在0～4℃下浸泡固定60～120分钟。
（4）脱水：用丙酮脱去组织内的水分，从30％或50％开始，经70％、90％梯度丙酮处理10分钟，然后入纯丙酮，更换3次，需40分钟左右。
（5）浸透，组织块入纯丙酮：树脂包埋剂（1∶1），室温下浸泡1小时；换入丙酮∶包埋剂（1∶2）浸透2小时；然后进入纯树脂包埋剂浸透3小时以上或过夜。
（6）聚合：将浸透充分的组织块，放入灌满包埋剂的胶囊中，在37℃烤箱内聚合12小时，然后入60℃烤箱聚合24小时。目前常用的包埋剂型号有环氧树脂618、812、Spurr、K4M 树脂等。使用环氧树脂812作包埋介质，应避免潮气。操作过程中干燥是关键问题，否则有可能产生聚合不均、硬度和弹性不当等后果，影响超薄切片。
（7）切片：用超薄切片机先做半薄切片（1μm）或薄切片（3μm 左右）进行光镜检查定位，再做超薄切片（40～50nm）。
（8）捞片及染色：用镊子夹一铜网，将满意的切片捞在铜网中央，先用2％醋酸铀染色30分钟，再用6％柠檬酸铅染色30分钟。
2.血液和骨髓样本的制备技术
（1）血液样本的制备：①经1％肝素或5％EDTA 抗凝的静脉血2～4ml，②1000～1500rpm 离心10分钟；③尽量吸取上清液，沿管壁缓慢加入2％～4％戊二醛1～2ml；④固定2～4小时，使浅黄色层凝结成块；⑤取浅黄色层，切成1mm3细条放缓冲液漂洗；⑥按常规组织块标本制备方法进行后固定、脱水、包埋等步骤。（注：包埋时要把细条平放）（2）骨髓样本的制备：①经1％肝素或5％EDTA 抗凝的骨髓穿刺液0.5～1ml；②离心后取髓粒或直接细心挑取髓粒；③2％～4％戊二醛磷酸钠缓冲固定液固定2～4小时；④按常规组织块标本制备方法进行后固定、脱水、包埋等步骤。
3.游离细胞标本制备技术
（1）游离悬浮细胞经离心沉淀或其他方法使细胞相对集中，将不必要的成分分离开，然后用0.1mol／L 二甲砷酸钠缓冲液或0.1mol／L 磷酸钠缓冲液漂洗。
（2）1.25％戊二醛／二甲砷酸钠缓冲液或0.1mol／L 磷酸钠缓冲液悬浮固定，4℃，30～60分钟。
（3）离心1000rpm，5分钟，去上清液。
（4）用同上缓冲液漂洗标本，15分钟。
（5）重复第3、4步骤，共漂洗3次，离心后尽量吸取上清液。
（6）加1～2滴新鲜血浆并用细针搅拌均匀，也可用2％琼脂或7％明胶代替血浆。
（7）缓慢加入2％戊二醛，静止2小时使细胞凝成团块。然后取出切成1mm3小块放缓冲液漂洗。
（8）按常规组织块标本制备方法进行后固定、脱水、包埋等步骤。
4.负染色技术
（1）毛细吸管将液体标本滴到有支持膜的载网上，根据标本的浓度可立即或放置数分钟或更长时间。
（2）用滤纸在悬滴的边缘处吸去余液，然后立即滴上磷钨酸（pH6.4～7.0）染液，一般数秒至1～5分钟，可将染液用滤纸吸干。
（3）进行电镜观察或放置于干燥箱内保存，随时观察。
（二）扫描电镜生物样品制备程序
1样品表面处理采用缓冲液、有机溶剂、酶消化等方法，清除和清洗附着在样品表面的粘液、血液、组织液及灰尘等。
2固定将清洗后的样品用戊二醛、锇酸等固定液进行固定1小时。
3脱水用梯度乙醇或丙酮脱水。
4置换样品脱水至100％乙醇或丙酮后，用纯丙酮置换15～20小时，以使醋酸异戊酯能更好地渗入样品中。
5醋酸异戊酯处理将样品用醋酸异戊酯浸泡15～30分钟，以使液态CO2容易渗入样品中。
6装样将样品从醋酸异戊酯中挑入样品笼中，然后连笼移入临界点干燥仪的样品室内，在0℃预冷10～15分钟，以保证液态CO2浸入样品室。
7注入液态CO2或干冰依次打开CO2钢瓶排气阀和仪器进气阀，在0～10℃下，向样品室逐渐注入液态CO2至样品室容积的80％，关闭进液阀，停止充液。
8置换将温度设定在20℃以下，样品中的醋酸异戊酯与CO2充分置换。
9气化将温度旋钮调至临界温度以上（35～40℃），此时随着温度升高，CO2由液态变为气态，界面也随之消失。当气压达到7134Pa时，经5分钟后，即可排气。
10排气打开流量计排气阀门，以1.0～1.5L／min 的速度排气，约经45～60分钟排气完毕。
以上第6～10步骤在临界点干燥仪上进行。
11喷涂将样品置于离子溅射镀膜仪的样品台上进行金属镀膜。
12进行观察，然后将样品装入扫描电镜的样品室进行观察。