圣诞宴会过后不久，1941年1月4日，新四军军部及其所属部队九千余人，从皖南云岭等地，按蒋介石的限令，开始向北转移，6日行至茂林时，突然遭到国民党军队顾祝同、上官云相所部七个师八万人的袭击。
毛泽东、朱德、王稼祥几乎一日一电，向周恩来通告新四军情况。1月13日，他们又发来了向国民党当局交涉致周恩来、叶剑英的电报：
希夷（叶挺）军部率六个团仍在泾县以南茂林地区围困中，并没有出来，现粮尽弹绝，处境极危，有全军覆没之可能。虽有傅秋涛两个团突出至宁国山地，亦未突出大包围线外，请严重向重庆提出交涉，并向全国呼吁求援等语，请向当局提出最严重交涉，如不立即解围，我们即刻出兵增助，破裂之责由彼方担负。我们今日发出之通电，望立即散发。
周恩来接电后，当天就打电话找顾祝同交涉，并且动员办事处干部向蒋、何、白等提抗议。军委会次长刘为章在何应钦家里，接到周恩来的电话，立即赶来面见周恩来。事情紧急，不及寒暄，周恩来便严正提出：
“请你转告蒋先生、何总长，即令顾祝同解除对新四军的包围，并让出去苏南的道路，否则被围部队势将被迫分散，江南局面仍不能解决。我可以告诉你，我八路军将士得知新四军的遭遇，无不气愤填膺，如果事端发展下去将意味着什么，你应该很清楚，我们不想看到抗战军人自相残杀的悲剧。”
“一定转告，一定转告。”刘为章直点头。
周恩来：“只有迅速解除围攻，才能挽救危机于万一。”
刘为章：“蒋委员长已令侍从电告顾长官，只要新四军北渡，不应为难。”
周恩来：“北上必经苏南，皖北绝对走不通，你一定要给蒋先生、顾长官讲清楚。”
刘为章：“你放心，我回去马上再给顾祝同发一电，嘱其执行。”
刘为章匆匆告辞，不久打来电话：“我已将你的意见报告了蒋委员长。”
“他怎么说？”周恩来紧握住耳机。
“蒋委员长的答复是———”从耳机喳喳的声音判定，刘为章是在打开笔录本：“蒋委员长说，他12日晚已下了停打的命令。对新四军今后走苏北，提出两个条件：一是过江后不得打韩德勤，二是不得继续盘踞，要遵命到黄河以北去。蒋委员长还让我今晚即向顾祝同传达他的意见，请中共方面即电告前方。”
刘为章的电话刚挂断，张冲的电话又到了，听得出，他也很着急，呼吸声吹得耳机呼呼作响：“恩来先生，我告诉你，何总长已与顾祝同通过话了，告以委员长已允新四军假道苏南渡江，令各军不要阻止。”
周恩来将话筒抓得再紧些，问：“顾祝同怎么讲？”
“他答应照办。但声明现已与新四军电台失去联络，要中共立即催新四军与之联络。”
周恩来放下电话，静思片刻，立即给毛泽东拟电：建议令叶挺、项英、饶漱石立即据此同顾祝同恢复电台关系，要顾依蒋令解围让路。还建议告叶、项万勿再向顾打长他人之志、灭自己威风的电报，今后给蒋、何的电报，必须经延安转。
毛泽东接到电报，光火了，回电说：现在不是走何路线问题，而是救死问题。如不停止攻击，即将全军覆灭，请立即要蒋下令停战撤围。……叶、项、饶主力尚在茂林原地，被数万大军围攻，现已血战八天，十分危险！
被迫还击的新四军，血战七昼夜，因寡不敌众，弹尽粮绝，七千多人壮烈牺牲，军长叶挺被俘，副军长项英遇害。这就是震惊中外的“皖南事变”。事变发生后，国民党封锁消息，掩盖事实真相，颠倒黑白。1月17日，蒋介石公然宣布新四军为“叛军”，取消番号，并将叶挺交军事法庭审判。
当“皖南事变”最后的消息通过延安电台传给周恩来时，周恩来正在开会，庆祝《新华日报》创办三周年。这张报纸连夜把周恩来关于这个事件的文章赶印出来，但却被国民党查扣了。周恩来抬头望了一眼屋顶。楼上住着叶剑英。因为顶楼没有窗，在这样闷热的夏天，叶剑英挪开了几片瓦，在屋顶开了个洞透气。后来一场倾盆大雨从洞口直灌室内，透过满是缝隙的地板，流进周恩来的卧室和办公室。那一天，他在屋里打着伞会客。现在这一场政治风暴来临，刮来的是腥风血雨……《新华日报》以开天窗表示沉默抗议。其中一处是周恩来奋笔疾书填上的：
千古奇冤，江南一叶，同室操戈，相煎何急！
他抓起电话，直接打给何应钦：“你们的行为，使亲者痛，仇者快。你们做了日寇想做而做不到的事。你何应钦是中华民族的千古罪人！”随即驱车到国民党谈判代表张冲处，当面提出质问和抗议，再返回红岩。
一些知名人士如侯外庐、翦伯赞等心急火燎，登门去看周恩来，担心地问：“国共会不会从此破裂？抗战会不会因此而夭折？”
周恩来笑了一下，气愤地说：“党的方针，就是争取时局的好转，但同时还要准备更坏的局面出现。至于抗战能不能继续下去，那决不是蒋介石一人所能决定的！”
事实果然如此。
就在蒋介石绞杀新四军时，他突然发现自己陷入了内外交困、空前孤立的狼狈境地，这是他根本没有料想到的。更加出乎他意外的是，连日本军队也没有因为他发动反共内战而停止进攻。1月下旬，日军发动豫南战役，将国民党军队15万人包围在平汉铁路以东，两军发生激战。他开始尝到了自己酿造的苦酒。
他万分焦灼的是：原先定于3月1日召开的国民参政会迫在眉睫。许多民主人士和无党派人士表示，如果中共参政员缺席，会议也没必要开了……罗斯福的代表居里也留在重庆不走，据说是专等观光国民参政会开会。他突然挺直腰，向弯腰曲背站着的陈布雷布置：“一定要把共产党人拉进参政会来，你和周恩来联系一下，我要与他好好谈谈！”