文冠果又名木瓜、文登阁、崖木瓜等，属无患子科文冠果属，是中国特有的温带木本油料植物，其种子含油率达30%～60%，种仁含油率高达55%～66%，被誉为“北方油茶”。在石油资源日益枯竭的今天，文冠果作为重要的生物质能源树种，由于其耐旱、耐贫瘠、适应性广的特性，无疑具有更大的发展潜力。
文冠果属于组织培养繁殖困难的树种，本实验以种子为材料，诱导体胚发生，进行文冠果细胞悬浮培养，利用此手段来解决文冠果组织培养繁殖率低的问题。
体细胞胚胎发生在植物组织培养中普遍存在。体细胞胚胎的悬浮培养是植物离体快繁的途径之一，此法与由茎段诱导植株相比，有繁殖速度快、繁殖系数高的优点，能用于大规模的生产。
一、材料
文冠果种子。
二、初期愈伤组织的诱导
在超净工作台上，将种子浸泡到60℃热水中（种子∶水=1∶3），当温度降为30℃时用无菌水漂洗，剥去种皮。种胚先用70%酒精处理10s，无菌水冲洗3次，再用0.1%氯化汞溶液消毒5min～8min，无菌水冲洗5次，然后将种胚切成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的碎块，然后采用无菌操作的方法接种。培养基分别为：M1：
MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+2，4-D0.5mg/L+蔗糖3%，M2：MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖3%，M3：MS+6-BA0.5mg/L+2，4-D0.5mg/L+蔗糖2%，琼脂浓度均为0.6%，pH值均为5.8。置于温度为25℃±1℃的培养室进行暗培养。
三、胚性愈伤组织的诱导
将初期所获得的愈伤组织接种于所设计的不同浓度不同配比的液体培养基当中，分别是：M4：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+2，4-D0.5mg/L+蔗糖2%，M5：
MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖2%，琼脂0.6%，pH值5.8。暗培养40d，放在摇床上进行悬浮培养，摇床转速为90r/min～100r/min。冲程范围在2cm～3cm，继代时间相隔7d。
四、体细胞胚胎的发生和植株再生
将所获得单细胞一部分继续放于筛选出的液体培养基当中，悬浮暗培养10d～15d，摇床转速为90r/min～100r/min，观察是否出现子叶胚。另一部分接入所设计的不同激素配比的固体培养基上，进行植株再生培养。
培养基分别为：M6：MS+6-BA1.0mg/L+IAA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+LH200mg/L，M7：MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D0.2mg/L+NAA0.2mg/L+LH200mg/L，M8：MS，M9：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L，琼脂0.6%，蔗糖3%，pH值5.8。按照培养目的不同，添加不同浓度细胞分裂素和生长素，置于23℃±2℃培养室培养，光照时间为12h/d，光照强度为120μmol·m-2·s-1左右。
五、文冠果细胞悬浮培养中初期愈伤组织的诱导
当6-BA浓度一定时，NAA和2，4-D组合使用更有助于胚性愈伤组织的形成，即M1处理效果最好；当只有NAA作用时，文冠果形成愈伤组织的同时，更有利于萌芽诱导培养，没有NAA作用时，培养基内2，4-D更有利于愈伤组织形成，但是不萌芽，即M3处理效果最弱。
六、文冠果胚性愈伤组织诱导
采用6-BA0.5mg/L+2，4-D0.5mg/L+NAA0.5mg/L组合，有利于胚性愈伤组织诱导，因此利用此配比的液体培养基进行细胞悬浮培养，容易获得体细胞胚。
七、文冠果再生培养
本研究的四种培养基中，只有MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L较适合单细胞团再生植株培养。试验表明，NAA和2，4-D共同作用下单细胞团更易膨大，但不萌芽，只有在一定浓度的NAA单独作用下，才更有助于愈伤组织萌芽诱导的培养。
八、讨论
在文冠果悬浮培养实验中，综合其诱导愈伤率，胚性愈伤组织生长时间和生长状况，发现三种培养基当中，NAA和2，4-D混合使用更有助于胚性愈伤组织的形成；只有一种生长素2，4-D作用时，只形成愈伤组织，说明胚性的获得还需要一定浓度的NAA配合使用。当1.0mg/LNAA单独作用时，不仅形成愈伤组织，且愈伤组织有萌芽现象。说明一定浓度的NAA对文冠果愈伤组织萌芽培养有很大的促进作用。但从后期单细胞团诱导萌芽培养试验当中，发现植株再生率还不是很高，可能NAA的浓度还较低，或是一种生长素的作用不足以促进单细胞团萌芽再生。本研究将继续补充试验，提高单细胞团萌芽率，从根本上达到解决文冠果繁殖系数低，繁殖速度慢等问题的目的，为文冠果的产业化和规模化发展提供可靠的技术服务平台。
【思考题】
1.体细胞胚胎的概念是什么？
2.胚性愈伤组织的概念是什么？
3.体细胞胚胎发生的方式有哪几种？
4.影响体细胞胚胎发生的因子有哪些？
5.怎样判断体细胞胚胎是否成熟？
6.胚性愈伤组织指什么？有什么特点？
7.细胞悬浮培养中的操作要点是什么？