一、缓冲液的配制
1.马铃薯样品提取缓冲液组成成分
用900mL蒸馏水稀释下列物质：
（1）三羟甲基氨甲烷60.5g
（2）氯化钠8.0g
（3）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）MW24-40，00020.0g
（4）聚乙二醇10.0g
（5）叠氮化钠0.2g
（6）吐温-200.5g
注意：用盐酸调整pH值到8.2，再用蒸馏水定容到1000mL，4℃下贮存。
2.包被缓冲液组成成分
用1000mL蒸馏水稀释下列物质：
（1）碳酸钠（无水）1.59g
（2）碳酸氢钠2.93g
（3）叠氮化钠0.2g
注意：调节pH值到9.6，4℃下贮存。
3.PBST缓冲液（洗涤缓冲液）组成成分
用1000mL蒸馏水稀释下列物质：
（1）氯化钠8.0g
（2）磷酸氢钠（无水）1.15g
（3）磷酸二氢钾（无水）0.2g
（4）氯化钾0.2g
（5）吐温-200.5g
注意：调整pH值到7.4。
4.ECI缓冲溶液
用1000mL1倍PBST稀释下列物质：
（1）牛血清蛋白（BSA）2.0g
（2）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）MW24-40，00020.0g
（3）叠氮化钠0.2g
注意：调整pH到7.4，4℃下保存。
5.PNP缓冲液
用800mL蒸馏水稀释下列物质：
（1）MgCl2·6H2O0.1g
（2）叠氮化钠0.2g
（3）二乙醇胺97.0mL
注意：用盐酸将pH值调为9.8，再用蒸馏水定容到1000mL，4℃下贮存。
二、样品的提取
称取0.2g马铃薯叶片或叶柄，按1∶5的比例加入提取缓冲液，然后在研钵中将其捣烂，置于冷冻离心机中（4℃，10000rpm）离心20min，吸取上清液备用。
三、检测操作
1.包被
（1）包被抗体在每个反应孔中加入100μL抗体稀释液（按产品说明书上进行稀释）。
（2）孵育在恒湿箱中，室温下（25℃）孵育4h或在4℃条件下过夜。
（3）洗板
孵育结束后，将反应孔中的试剂倒出加入250μL的1倍PBST缓冲液，之后快速倒出，重复4次～8次将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体。
2.点样及孵育
（1）点样。根据实验设计图表，取100μL样品提取稀释液到各样品孔中。取100μL样品提取缓冲液到缓冲液对照孔中。
（2）孵育。在恒湿箱中，室温下（25℃）孵育2h或4℃条件下过夜。
3.酶标记物的制备
将ECI缓冲液稀释到1倍，根据酶标记物标签上的稀释倍数将酶标记物加到1倍ECI缓冲液中，混合均匀根据使用量来确定酶标记物稀释液的体积。
注意：1mL的酶标记物稀释液足够8个反应孔使用，10mL的酶标记物稀释液够96个反应孔使用。
酶标记物请在孵板结束前的10min内制备完成。
制备过程请使用清洁的、未使用过的移液管。
4.洗板、加酶标记物稀释液及孵育
（1）洗板。步骤同上。
（2）加酶标记物稀释液。在各反应孔中加入100μL酶标记物稀释液。
（3）孵育。在恒湿箱中，室温下（25℃）孵育2h。
5.PNP底物的制备
孵育结束前的15min制备PNP底物溶液。在室温下用5mLPNP缓冲液（1倍浓度）溶解1片PNP底物片。每片PNP底物片可溶解成5mL的底物溶液，溶解比例为1mg/mL，大约够40个反应孔使用。
注意：请勿直接接触PNP底物片或将底物溶液暴露在强光下。直接接触或强光刺激会在阴性反应孔中导致背景色干扰。
6.洗板、加PNP底物溶液及孵育
（1）洗板。步骤同上。
（2）加PNP底物溶液。在各反应孔中加入100μLPNP底物溶液。
（3）孵育。在恒湿箱中孵育30min～60min。
7.终止反应
孵育结束后，在各反应孔中加入50μL3M的NaOH终止反应。这一步可以选做。
四、结果
直接用肉眼观察或用酶标仪在405nm波长下测量结果。
阳性结果：微孔中有明显颜色变化。
阴性结果：微孔中没有明显颜色变化。
注意：只有在阳性质控孔得到阳性结果的时候，实验结果才是可靠的。结果可保持1h左右。
（只要阴性质控孔不发生颜色变化）【思考题】
1马铃薯病毒病ELISA检测方法中缓冲液的组成和浓度分别是什么？
2.阳性结果和阴性结果在试验结果中分别代表什么？作用是什么？