一、低温及抑制生长保存
低温保存是让培养物在培养基上生长一段时间后移入一定低温条件下（1℃～9℃）保存，使用此法可使培养物保存几个月甚至1年以上。为了使培养物能长期处在缓慢的生长状态，必要时采用继代培养的方法，把培养物定期转移到新鲜的培养基上再培养。
在低温条件下，结合生长抑制剂的应用，试管内长期保存植物材料不但方法简单，而且植物材料复苏快、生活力高，对一般组培保存原种材料极为实用。
二、超低温保存
超低温一般是指液氮低温，即-196℃。在此温度下，几乎所有的细胞代谢活动、生长过程等都停止了。细胞、组织和器官在超低温保存的情况下不会引起遗传性状的改变，却仍能保存细胞的活力和形态发生的能力。
1.主要步骤
（1）材料的选取。可以用超低温保存的材料有：茎尖分生组织、小球茎、愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、花粉等。
（2）冰冻前的预处理。预处理的目的是增加细胞分裂，提高分裂细胞的比例；减少细胞内自由水的含量；增强细胞的抗寒力。
预处理的方法有：加速培养物的继代频率，提高分裂细胞的比例；把培养物置于接近零度低温（0℃～5℃）下驯化培养一段时间（30d左右）；把培养物投入约0.7mol/L蔗糖的高浓度溶液中，促使材料脱水；用二甲基亚砜（5%～8%）、脯氨酸（10%）、甘油（22%～50%）等冷冻保护剂在0℃左右条件下处理待超低温保存的材料。
常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜（DMSO）、甘油、乙二醇、糖类、脯氨酸、乙酰胺等。许多试验指出，采用复合冷冻保护剂比单一成分的冷冻保护剂的效果要好。
（3）降温冷冻操作：材料经冷冻保护剂处理后要立即降温冰冻，最后放入液氮中保存。从0℃～5℃降至-196℃的降温过程，传统的降温方式有快速冰冻法，慢速冰冻法和两步冰冻法。
快速冰冻法：将需保存的材料经预处理后直接投入液氮中保存。
慢速冰冻法：它是以每分钟下降0.1℃～10℃的速度进行冰冻。在这种降温速度下，通过胞外结冰，使细胞内的水减少到最低限度，从而达到良好的细胞脱水效应。
两步冰冻法：第一步是用慢速降温，降至-30℃～-50℃，使细胞达到适当的保护性脱水，在此低温下平衡1h左右；第二步将材料投入液氮中迅速冰冻、保存。
冰冻保护液常可用适宜的植物培养基配制，并将蔗糖浓度提高到0.4mol/L～0.5mol/L。不同的植物材料选用不同的冰冻保护剂。在冰冻保护液中的处理时间随各种不同的材料而不同，且差异很大，康乃馨茎尖需5min，樱桃茎尖是80min。
2.保护材料的化冻操作
化冻的速度是解冻技术的关键。化冻操作一般是将材料从液氮中取出后立即投入25℃～40℃的热水浴中快速解冻。对于木本植物冬芽的超低温保存后，常常要在0℃低温下进行慢速化冻，才能得到最好的结果。
3.化冻材料的再培养
化冻材料在再培养前，一般需要用培养液洗几遍（每次10min左右），以去除冰冻保护剂的残留毒害，也免除了质壁分离复原对细胞的损害。化冻后再培养的材料，有时细胞生长略有一段滞后期，即化冻后的细胞不能立即恢复生长，需要一定时间的恢复期。
三、干燥保存法
培养物脱水时，先将材料表面的液体用无菌滤纸吸干，然后放入盛有干燥硅胶的真空干燥器中抽气干燥，使材料的含水量低于30%～40%即可。
四、液体石蜡层覆盖法
借助油层覆盖，隔绝空气，降低培养物的生长速度，并防止培养基干燥，可延长继代培养的间隔期，在低温条件下就可延长材料的保存期限。
五、低压和低氧气调贮存发
结合低温（0℃～4℃）贮藏，能抑制细胞的生理活动，延缓衰老，延长培养物的保存时间。
【思考题】
1.种质离体保存常用方法有哪些？
2.超低温保存的主要步骤是什么？
3.常用的冷冻保护剂有哪些？如何使用？
4.描述保护材料的化冻操作。