地椒为唇形科百里香属植物，多年生矮小半灌木或草本，有强烈香气，分布于内蒙古、河北、山西、山东、陕西、甘肃和青海等省，生长于海拔1000m～2500m的山地、流水两岸的草丛、河岸或沙滩。地椒可药用，民间用做香料，具有温中散寒，祛风止痛，解痉祛风，止咳化痰的功效，广泛用于治疗感冒、百日咳、喉头肿痛等多种疾病。全草搓绳点燃，可熏杀蚊虫，种子可做调味剂。
目前，主要用于芳香植物提取香精以及药用，近年来经过研究发现适合作为屋顶绿化材料和生态修复先锋植物。
一、材料
地椒带腋芽的茎段。
二、方法
1.外植体消毒
早上9：00～10：00采健壮植株带腋芽的茎段，饱和洗衣粉水刷洗表面，自来水冲洗2h，在超净工作台上用70%的酒精中消毒处理45s，然后用0.1%的氯化汞溶液分别消毒3min、5min、8min、10min，无菌水冲洗4次～5次，用无菌滤纸吸干多余的水分，剪掉茎段端部，接种于MS基中。每处理接种10瓶，每瓶接3个外植体，重复3次。4周后统计污染率、死亡率、成活率。
污染率=污染数/接种数×100%
褐化率=褐化数/（接种数-污染数）×100%
2.继代增殖
将获得的无菌芽分别接种在继代培养基上：
（1）MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.1mg/L（培养基编号①）
（2）MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L（培养基编号②）
（3）MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.1mg/L（培养基编号③）
本文涉及到的培养基无特别说明，蔗糖浓度3%，琼脂浓度0.6%，pH值5.8～6.0，每处理接种10瓶，每瓶接3个芽，重复3次。3周后统计增殖系数、株高、叶片数。
3.生根
当芽长至1.5cm～2.0cm时，将其接种于培养基进行生根培养：
（1）1/2MS（培养基编号④）
（2）1/2MS+IBA0.2mg/L（培养基编号⑤）
（3）1/2MS+IBA0.4mg/L（培养基编号⑥）
每处理接种10瓶，每瓶接5个芽，重复3次。3周后统计生根率、平均根数、平均株高、生长势。
4.移栽
当植株转入生根培养基15d后，先将试管苗从培养室移入温室内，5d后打开瓶盖，露置1d，然后洗净根部培养基，移栽入基质中（草炭∶蛭石∶珍珠岩=1∶2∶1），移栽后2周内保持温度22℃±2℃，湿度80%～90%，移栽后每7d喷洒1次800倍多菌灵，每2周叶面喷施0.2%磷酸二氢钾，45d后统计移栽成活率。
三、结果与分析
1.外植体消毒时间的优化
在植物组织培养的消毒过程中，消毒时间决定了接种外植体的污染率和褐化率，消毒时间过短，外植体污染严重；消毒时间过长，外植体褐化严重。
随着消毒时间的增加，地椒外植体的污染率降低，褐化率增高，出芽率也随之降低。
消毒时间为10min，虽然污染率显着降低，但褐化率却也显着升高，且出芽率也显着降低。而消毒时间为8min，不仅污染率显着降低，与3min消毒时间相比，褐化率和出芽率也没有显着差异。综合各因素考虑，初步认为地椒外植体最佳消毒处理是：
70%酒精消毒处理45s，然后用0.1%氯化汞溶液消毒处理8min。
2.6-BA对地椒继代增殖的影响
将诱导出的芽接种于继代培养基中，结果表明：外源激素6-BA与IAA配比，对地椒的继代增殖有较大影响，特别是6-BA浓度变化的影响。随着6-BA浓度的增加，地椒的增殖系数显着增高，但生长势却显着降低，表现为叶片数减少，株高降低。同时，由于6-BA浓度的增加，玻璃化现象显着升高，这严重影响了地椒的继代增殖。综合以上各因素认为，以MS为基本培养基，配以0.5mg/L的6-BA和0.1mg/L的IAA比较适合地椒的继代增殖培养。
3.IAA对地椒生根的影响
地椒是一种易生根的植物，在不加任何外源激素的1/2MS培养基中，生根率达到65.3%。而IAA对地椒生根有显着的影响，当培养基中加入0.2mg/L的IAA时，生根率显着高于没加IAA的培养基，但随着IAA的进一步增加，生根率虽然没有显着变化，但生长势却有所抑制，表现为部分叶片发黄，这可能是由于适当浓度的生长素促进植物的生长，而过量浓度的生长素反而会抑制植物生长。因此，在1/2MS基本培养基中添加0.2mg/L的IAA适合地椒的生根培养。
4.地椒组培苗移栽情况
地椒组培苗移栽后2d，叶片开始萎蔫，但1周后便逐渐长出新芽，并伴随有新根长出，2周后叶色开始转绿，且根系发育良好，45d后移栽成活率可达到81.2%。
四、结论与讨论
试验结果表明，培养基中激素配比对地椒组织培养有较大影响。MS培养基能从地椒带腋芽的茎段外植体中诱导出芽，而培养基MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.1mg/L适合地椒的继代增殖，当获得的丛生芽经过继代增殖后需要在培养基MS+6-BA0.1mg/L+IAA0.1mg/L中进行复壮培养，防止玻璃化发生。为了提高生根率又不影响地椒的正常生长，应选用培养基1/2MS+IBA0.2mg/L作为生根培养基。
【思考题】
1.植物组织培养过程中污染率与褐化率如何计算？
2.外植体接种过程中常用消毒剂有哪些？使用浓度是什么？
3.外植体接种过程中消毒剂的使用浓度和消毒时间对材料的褐变有什么影响？如何防止？