1905年春，秋瑾带着任务回到离别半年多的祖国。到上海后，她持陶成章的介绍信，去上海爱国女校拜见了光复会会长蔡元培，畅谈自己的思想与报负。回到绍兴后，立即去寻访东浦热诚小学主持教务的徐锡麟。徐锡麟（号伯荪）个子不高，待人热情诚恳，会友都尊称他“伯荪哥”。经徐锡麟介绍秋瑾加入了光复会，使秋瑾在反清革命的道路上又向前跨了一大步。
“儿行千里母担忧”这是中国的一句俗话，秋瑾回家见到了日夜思念她的母亲，细细讲述在日本学习的情况和经济上的困难。虽然此时秋家早已衰落，可是慈爱的母亲不忍看到已是只身远游的爱女为筹集经费发愁，于是典卖了衣物为秋瑾凑了几百元钱。为了帮助实践女校招生，秋瑾奔走于杭州、绍兴等地，还向一些女子学校寄去招生启事，热情宣传女子走出闺房，轻装简束，东渡求学的好处，可是因封建阻力太重，收效甚微。这时学校来信催促，她便再次怀着惜别之情离开家乡赴日本。
1905年 6月底秋瑾离开浙江到了上海，碰见了从日本回国的陶成章，在陶成章的介绍下，秋瑾结识了浙江会党头目丁、吕熊祥等人，这些人在秋瑾后来的革命活动中，给予了很大帮助。
1905年7月暑气逼人，秋瑾登上海轮，整整六天的时间拥挤、劳累、寝食不周，使她刚到东京就大病一场。待病刚有好转，便于8月到青山实践女校报到注册。
青山实践女校是日本近代著名的女教育家下歌田子创立的，而女校附属“清国女子师范工艺速成科”是1904年下歌田子与当时驻日本的中国留学生监督范源濂等人合办的，专门招收中国女留学生。学习期限为一年，分作三个学期。
秋瑾读的是附属学校的师范科。学校校规很严，单独外出或单独与外人会见，必须有保证人。除星期天外，每星期最多只允许出校门两次等等。开设的课程也多，有日语、教育、心理、修身、理科、历史、地理、算术、汉语、图画、体操、唱歌等。学校的教育、管理和监督主要由日本教员担任。
学习刻苦是秋瑾的一贯作风。她在学校只念了一个学期，在这个学期里她共选读九门功课。每周上33节课，外加六小时自修课。每天阅读、写作常到深夜，经常要人再三劝说，才放下书本。为了保护身体健康，她经常做体操，进行体育锻炼。
刻苦学习的同时，生活却很清贫。由于留学开支大，所需学费、书籍、纸、笔和膳费等必要支出后剩下无几，秋瑾严格限制自己的其它花费。平时外出总是步行来往，这对缠过脚的人来说更增加了困难。
紧张的学习，清贫的生活和严格的校规并没有减弱秋瑾对革命事业的热情。她买了一把倭刀，时时带在身旁不忘习武。还到东京神乐坂武术会去练习射击，以便适应革命工作的需要。她甚至认真学习如何制做炸药，把别人有关制炸药的笔记全借来抄下。
1905年是值得人们记忆的一年，在这一年里出现了中国旧民主主义革命的大事——中国同盟会建立。随着国内民族资本的不断发展，民族资产阶级的力量也在增长。出国留学的人数猛增，革命的刊物大量涌现，革命小团体相继成立，革命形势迅速地发展。到1905年，建立一个全国统一的政党领导革命运动已是迫在眉睫。
1905年7月，孙中山由欧洲抵达日本，在留日学生何香凝家设立临时联络点，会见在日本的中国革命志士。经过与黄兴、陈天华等人商议，决定以兴中会、华兴会为基础，联合光复会和其它组织成立统一革命政党中国同盟会。
7月30日，东京赤坂区桧町“黑龙会”会所内气氛热烈而又紧张，来自17个省的留学生代表和一些日本友人共 60余人，在这里举行中国同盟会的预备会。会上，孙中山详细地分析了中国的形势，指出了各革命组织联合起来的必要性。提出将“驱除鞑虏，恢复中华，创立民国，平均地权”作为中国同盟会的纲领，经过代表们热烈的讨论后通过。大会还一致推举孙中山为同盟会总理。同盟会预备会议的内容迅速传到留日的革命学生中，激起了学生的极大热情。8月13日，东京富士见楼聚集了 1300多名学生，集会欢迎孙中山。孙中山作了激动人心的演说。8月20日，中国同盟会正式成立，通过了会章，决定总部设在东京，又先后推定了各省的“主盟人”。同盟会的成立极大地促进了中国革命运动的发展。
还在8月中旬时，秋瑾经冯自由介绍加入同盟会。入会手续在黄兴的寓所履行。秋瑾举起右手庄严地发出誓言：“秋瑾当天发誓：驱除鞑虏，恢复中华，创立民国，平均地权，矢信矢忠，有始有卒，如或渝此，任众处罚！”
宣誓完毕，由黄兴教给同盟会员相见时的握手暗号和三种秘密口号。
秋瑾加入同盟会早（是浙江籍留学生中第二人），素来立场鲜明，斗争性强，因此被举为评议员、浙江主盟人。这是秋瑾在革命道路上迈出的决定性一步，她将革命事业溶入了自己的生命之中。
反动的清政府不断地与革命势力较量，为了巩固统治，继1901年“新政”颁布后，1905年又要准备“立宪”，派遣载泽等五大臣出洋“考察”。为了阻止清政府骗局实现，一位革命党人吴樾在9月24日这天，以大无畏的精神怀揣炸弹，赶到了北京火车站。他要炸死这五个大臣。上车的人很多，还没有等吴樾靠近五大臣，怀里的炸弹被拥挤的人们激烈碰撞爆炸了。五大臣中只有两人受了轻伤，吴樾壮志未酬不幸牺牲。秋瑾听到吴樾的牺牲过程后，心中万分悲痛。漫漫长夜，她悲愤地彻夜不能眠，奋笔疾书《吊吴烈士樾》“昆仑一脉传骄子，二百余年汉声死。皖中志士名吴樾，百炼钢肠如火热。报仇直以酬祖宗，杀贼计先除羽翼。爆裂同拼歼贼臣，男儿爱国已忘身。”她不仅为烈士的舍身取义精神所感动，还号召天下同仁学习烈士“前仆后继人应在，如君不愧轩辕孙！”文章读来令人荡气回肠，在留日学生中争相传诵。
离吴樾牺牲不到三个月的时间，留日学生中又出现了一件让人痛心不已，充满牺牲精神的事情——同盟会领导人之一、杰出的宣传家陈天华投海自杀。
内外交困的清政府，得知孙中山等革命党人在留日学生中宣传革命，还成立了中国同盟会，恐慌不安。多次要求日本政府驱逐留日的革命党人，并限制留日中国学生的活动。日本政府“贪中国之权利”，与清朝政府勾结起来， 11月文部省颁布了所谓《取缔清国留学生规则》，规定中国留学生只能入日本政府指定的学校，还必须有清朝公使馆的介绍信。对留学生的书信、活动、住宿等以登记或加以限制。规则刚一公布，留学生哗然，群情激愤的学生以8000人罢课的方式进行抗议。与此同时，组织敢死队与日本政府和中国驻日公使交涉，秋瑾被公推为敢死队队长，毅然率领敢死队前往。交涉毫无结果，还有些日本报纸诬蔑中国留学生是“乌合之众”“放纵卑劣”。面临困境和辱骂，应该怎样行动呢？留学生们自然地分成两派：一派主张立即回国，在上海办校，秋瑾、陈天华等持这个观点。另一派认为既然来求学，就要忍辱负重，学成以后归国。双方争执不下，甚至争吵起来。眼看日本政府对中国留学生的排斥，而留学生内部又混乱一团，陈天华心痛如焚，必须阻止日本政府关于《取缔清国留学生规则》的执行，结束留学生中无谓的争吵，让大家团结一心一致对外，陈天华决心以死来作警钟，惊醒留学界。12月8日陈天华这位血性男儿留下长篇绝命书，纵身跃入大森海湾，壮烈牺牲，死时才30岁。
陈天华之死震惊了留学界，也激起了留日学生的义愤。留学生们立即召开追悼会，由秋瑾主持会议。会上大家发言，表示要记住他的遣言“共讲爱国，更卧薪尝胆”。秋瑾满怀悲愤发表演讲，号召全体留学生回国，说到激动处，随手抽出倭刀，“啪”的一声插入桌子上，大声喊道：“若有人回到祖国，投降满虏，卖友求荣，欺压汉人，吃我一刀！”
《取缔清国留学生规则》最终没有实行，留日学生的斗争取得了胜利。待事情平静下来，许多学生感到：全体回国，中断学业，就是半途而废，只能使革命事业受损失。孙中山此时打来电报，不赞成全体回国。
秋瑾坚持义不受辱，决定回国，可也不似当初那样情绪激动。认为若真能忍辱以成救国大业，这样的辱是暂时的，而祖国强盛了则永不受辱。她还表示自己回国以后，要全力投入革命事业“成败虽未可知，然苟留此未死之余生，则吾志不敢一日息也。”意思是说：革命成功与否，虽然还不知道，可只要我活着就一天也不改这个志愿。
1905年12月底秋瑾由东京动身回国，结束了一年多的留学生涯。这一年中，秋瑾接受了资本主义文化教育，结交了大批革命同志，加入了光复会和同盟会，已从一个具有反抗封建势力精神，关心祖国命运的单纯女子成长为自觉的民主主义革命家。她肩负重任，以新的精神境界迎接新的挑战。