结果:糖原及其他PAS 反应阳性物质呈红色,细胞核呈蓝色。
注意事项:
(1)糖原固定必须及时取小块组织进行固定,以免固定不透或不均,而在固定不好的组织切片中,可出现糖原颗粒趋于细胞一端的情况。
(2)配制Schiff试剂的重亚硫酸钠需质量优良,不能用陈旧无硫的刺激性试剂。
(3)染色前将Schiff试剂取出后,适应室温再进行染色,室温在15℃以下时可用40℃温水稍加温进行反应。
七、粘液物质(粘多糖)染色
Mowry阿尔辛蓝过碘酸雪夫(ABPAS)染色法(1956年)试剂配制:阿尔辛蓝染色液:阿尔辛蓝8GS1g,冰醋酸8GS 3ml,蒸馏水97ml。在溶液中加入麝香草酚2粒防腐。pH 为2.6~3.0。
染色步骤:
(1)中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水。
(2)蒸馏水浸洗1分钟。
(3)入3%醋酸液中3分钟。
(4)入阿尔辛蓝液中30分钟或更长时间。
(5)3%醋酸液3分钟。
(6)蒸馏水冲洗3次。
(7)0.5%过碘酸氧化10分钟。
(8)自来水冲洗,蒸馏水浸洗2次。
(9)在Schiff液中10~20分钟。
(10)流水冲洗2分钟,蒸馏水洗2次。
(11)无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
结果:中性粘液物质呈红色,酸性粘液物质呈蓝色,中性和酸性粘液的混合性物质呈紫红色。
注意事项:
(1)阿尔辛蓝染色时,其组织切片上不能涂白胶和火棉胶而防止脱片,因为这些胶体中含有糖类物质,容易与染色试剂结合使之背景着色。
(2)Schiff试剂使用后,应保存于冰箱中备用。使用时一般采取滴染色法。但对于已浸染色过的试剂,不能再回收使用,防止影响染色效果。
八、色素类染色
(一)脱甲醛色素方法
(1)中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水。
(2)用2%苦味酸无水乙醇饱和液1~5小时(须在染色缸中进行,防止乙醇液挥发而形成结晶)。
(3)自来水冲洗10分钟。
(4)蒸馏水洗后,按常规HE 染色法进行染色。在染色中最好用未有脱甲醛色素的切片作为对照观察。
(二)Masson Fontana黑色素银浸染色法(1929年)试剂配制:Fontana 氨性银液:用10%硝酸银水溶液20ml,逐滴加入浓氨水,至沉淀消失呈微乳白色,加蒸馏水20ml。
此液贮存在棕色试剂瓶内,置暗处过24小时后可应用。如果此溶液贮存在冷暗处,可保存1个月,但最好于2周内使用。
染色步骤:
(1)中性甲醛液或乙醇固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水。
(2)用蒸馏水充分洗涤。
(3)投入Fontana氨性银液,置于室温下暗处18~48小时。
(4)经蒸馏水洗数次。
(5)用0.2%氯化金水溶液处理1分钟。
(6)蒸馏水洗2分钟。
(7)用5%硫代硫酸钠水溶液固定2分钟。
(8)流水冲洗2分钟。
(9)PoneeauS染色液复染2~5分钟。
(10)无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
结果:黑色素及嗜银细胞颗粒呈黑色,胶原纤维呈红色,背景呈浅黄色。
注意事项:
(1)Fontana氨性银液置冰箱内保存时间不能太长,瓶口要封存好,防止因氨的丢失而发生沉淀。染色的器皿要洗干净,浸染色的试剂不能反复使用。
(2)PoneeauS染色液(详见结缔组织的胶原纤维染色法)用滴染法进行。如果用细胞核作对比染色,就可用核固红染色液。
(三)Ltllie 亚铁染色法
试剂配制:
(1)硫酸亚铁溶液:硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)2.5g,蒸馏水100ml。
(2)醋酸铁氰化钾溶液:1%醋酸水溶液100ml,铁氰化钾1g。
染色步骤:
(1)中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水。
(2)硫酸亚铁溶液中浸30分钟。
(3)用蒸馏水洗涤20分钟(需更换3次)。
(4)在醋酸铁氰化钾溶液中染10分钟。
(5)用1%醋酸液分化浸洗2次。
(6)PonceauS染色液复染2~5分钟。
(7)无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶或DPX 封固。
结果:黑色素呈暗绿色,背景浅绿或不着色,肌纤维和背景呈黄色。
注意事项:
(1)硫酸亚铁和铁氰化钾染色液临用时配制,不能存放。使用后的染色液及时处理。试剂瓶要洗干净。
(2)此染色法也可以使含铁血黄素呈阳性,可用结合铁反应法来进行鉴别。还可以用酸和碱及氧化剂进行脱色鉴别反应,而含铁血黄素溶解于酸,并结合形态学的特点进行对照,都能够清楚地区别。九、纤维素染色Lendrm 等MSB 染色法(1962年)本法的MSB 是指马休黄猩红蓝法(MartiusSarletblue,MSB)。
试剂配制:
(1)马休黄染液:马休黄0.5g,磷钨酸2.0g,95%乙醇100ml。
(2)亮结晶猩红6R 液:亮结晶猩红6R1.0g,蒸馏水97.5ml,冰醋酸2.5ml。
(3)苯胺蓝液:苯胺蓝0.5g,蒸馏水99ml,醋酸1ml。
(4)天青石蓝液:铁明矾2.5g溶于50ml蒸馏水内置室温过夜,加入0.25g天青石蓝,煮沸3分钟。滤过后盛入瓶中,再加入7ml甘油。此液可保存数月时间。
(5)Mayer明矾苏木素液(参见常规染色液配制,也可选用Harris苏木素液)。
染色步骤:
(1)中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水。
(2)用天青石蓝染核3~5分钟,自来水洗2分钟。
(3)用Mayer或Harris明矾苏木素染液5分钟。
(4)经自来水洗后,用盐酸乙醇稍分化。
(5)充分自来水洗3~5分钟。
(6)95%乙醇洗后,用马休黄液2分钟。
(7)蒸馏水浸洗1分钟。
(8)用亮结晶猩红6R 液染10分钟。
(9)蒸馏水洗1分钟。
(10)用1%磷钨酸液处理3~5分钟,蒸馏水洗1分钟。
(11)入苯胺蓝溶液中染5~10分钟。
(12)1%醋酸水溶液洗1分钟。
(13)无水乙醇脱水,二甲苯透明和中性树胶封固。
结果:纤维素呈红色,陈旧性纤维素呈紫色,细胞核呈蓝色,红细胞呈黄色。
注意事项:
(1)亮结晶猩红6R(brilliantcrystalscarlet6R)染料可用酸性复红(acidfuchsin)代替,也能够取得较好效果。
(2)无水乙醇快速脱水,稍干燥,再透明和封固。
(3)在做本法时也可以同时用Mallory 或Masson 三色法及改进V.GPonceau法进行对照染色。
十、淀粉样物质染色
(一)刚果红染色法
试剂配制:
(1)刚果红染色液:刚果红1g,蒸馏水100ml。
(2)Harris:苏木素染色液(见常用苏木素染色液的配制种类)。
染色步骤:
(1)中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水。
(2)苏木素染色液浸染2分钟。
(3)0.5%盐酸乙醇液分化数秒钟。
(4)自来水洗,蒸馏水洗2次。
(5)刚果红染色液中25分钟。
(6)无水乙醇迅速脱水2次。
(7)二甲苯透明,中性树胶封固。
结果:淀粉样物质呈红色,细胞核呈蓝色。
注意事项:
(1)苏木素染色的细胞核不能深,防止对比不清晰。
(2)淀粉样物可以结合偏光的方法取得良好效果,其色彩呈苹果绿色的双折光性。
(3)观察本法应对照HE 切片,由于含强碱性物质可以呈嗜伊红性。
(4)由于无水乙醇有脱色作用,脱水后即用冷风干燥,再透明和封固。
(二)Jurgens甲基紫染色法
试剂配制:
甲基紫染色液:甲基紫0.5g,蒸馏水100ml。
染色步骤:
(1)中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水。
(2)甲基紫染色液2ml,水洗1分钟。
(3)蒸馏水洗2次后,用0.1%醋酸水溶液分化30秒钟。
(4)蒸馏水洗2次,浸入饱和氯化钠内5分钟。
(5)蒸馏水洗2次,即用甘油明胶封固。
结果:淀粉样物质呈红色或紫红色,细胞核呈蓝色。
注意事项:
(1)醋酸分化液必须严格控制,以免褪色较多,需在显微镜下观察,使之淀粉呈红色为止。
(2)切片上要保留些水后及时封片。组织易褪色,应该及时显微镜照相。
十一、真菌染色
(一)Grocott六胺银染色法
试剂配制:
(1)六次甲基四胺、硝酸银原液(简称六胺银原液)、3%六次甲基四胺水溶液100ml,5%硝酸银水溶液5ml。临用时将两液混合呈现乳白色,瞬间透明。
(2)六胺银硼砂染色液:六胺银原液25ml,蒸馏水25ml,5%硼砂(四硼酸钠)水溶液2ml。
(3)核固红染液:核固红0.1g,硫酸铝5g,蒸馏水100ml。将硫酸铝溶于蒸馏水中,放入核固红染色剂煮沸,冷却,待形成饱和液后再使用。
(4)亮绿染色液:亮绿0.2g,蒸馏水100ml,冰醋酸0.2ml。
染色步骤:
(1)中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水。
(2)5%铬酸水溶液氧化1小时。
(3)流水洗2小时,蒸馏水洗2次。
(4)浸入1%亚硫酸钠水溶液去除铬酸1分钟。
(5)自来水洗5分钟,蒸馏水洗3次。
(6)浸入六胺银硼砂液染色1~1.5小时(于45~50℃温箱内),得切片呈浅棕色时。在镜下观察为准。
(7)蒸馏水浸洗3次。
(8)用0.2%氯化金水溶液调色3分钟,蒸馏水稍洗。
(9)核固红液染细胞核10分钟。
(10)自来水洗,蒸馏水洗。
(11)亮绿染色液30秒,用蒸馏水快速稍洗。
(12)无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
结果:真菌均被着色,菌丝和孢子呈黑褐色,细胞核呈红色,背景呈淡绿色。
注意事项:
(1)六胺银硼砂染色液在临用时配制,在恒温箱内染色1小时后,先取出一张切片,用蒸馏水洗去银液,在镜下观察,如果染色较淡,可再放回到染色液中。
(2)核固红染色液:放置时间不能过长,否则易失去染色效果。新配制的急用染色液,可冷却后过滤使用,染色时间3~5分钟即可。
(3)亮绿染色液,作为对比染色,其染色时间要短,不能过染,防止影响染色效果。此液有时省去步骤,均可得到较好效果。
(二)高碘酸复红染色法(1994年)
试剂配制:
(1)高碘酸氧化液:高碘酸0.5g,蒸馏水99ml,此液置冰箱内保存。
(2)Schiff染色液(参照糖类的糖原染色法)。
(3)马休黄染色液:马休黄0.5g,95%乙醇98ml,磷钨酸0.5g。
染色步骤:
(1)中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水。
(2)高碘酸氧化液10分钟。
(3)流水洗2分钟,再用蒸馏水洗2次。
(4)入Schiff染色液中15~20分钟。
(5)流水浸洗5分钟。
(6)马休黄染色液滴染数秒钟。
(7)直接用无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
结果:真菌呈紫红色,红细胞呈浅黄色。
注意事项:
(1)高碘酸氧化液不能存放在冰箱内时间过长,否则会失去氧化效果。
(2)Schiff液存放于冰箱内备用,染色时可以冷染色,但要适当延长时间,当室温低于15℃时,应在染色盒内放些温水(约35℃)加快染色时间。
(3)马休黄液染色后,用无水乙醇脱色时可见切片上呈淡黄色为此。
十二、细菌染色
(一)Gram 碱性复红结晶紫染色法
试剂配制:
(1)苯胺油苯酚复红液:碱性复红(盐基品红)0.5g,苯胺油1ml,苯酚1g,30%乙醇70ml。碱性复红溶于70ml乙醇中,加热至90℃,冷却后再加苯酚及苯胺油。
(2)碘液:碘片1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。
(3)结晶紫液:草酸铵1g,95%乙醇20ml,结晶紫2g,蒸馏水80ml。结晶紫溶于乙醇,草酸铵溶于蒸馏水,二液混合,置冰箱中保存可用较长时间。
染色步骤:
(1)中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水。
(2)苯胺油苯酚复红液5分钟。
(3)自来水洗,再用蒸馏水洗。
(4)4%甲醛(易褪色)1分钟,蒸馏水洗2次。
(5)苦味酸饱和液处理2分钟(当时看不见红色)。
(6)经过95%乙醇速洗后,放入自来水中立即变红色。
(7)蒸馏水洗2次后,用结晶紫液染色2分钟。
(8)自来水冲洗,再用蒸馏水洗。
(9)碘液作用2分钟,用水洗后,直接用滤纸吸干。
(10)二甲苯苯胺油等份混合,进行分化(镜下观察)(11)二甲苯透明,中性树胶封固。
结果:革兰阳性细菌呈蓝色,阴性细菌呈红色,细胞核呈红色。
注意事项:
(1)苯胺油苯酚复红液是一种不稳定的混合液,染色液表面易产生氧化结晶,染色时应适当加热防止氧化物质污染切片。
(2)二甲苯苯胺油分化后,须二甲苯洗除,才能在镜下观察,如果分化不足,可再进行褪色。
(二)Ziehl-Neelsen抗酸杆菌染色法
试剂配制:
苯酚复红液:碱性复红1g,纯乙醇10ml,苯酚5%水溶液100ml。碱性复红溶于乙醇内,然后与苯酚水溶液相混合,用前过滤。
染色步骤:
(1)中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水。
(2)入苯酚复红液1小时左右。
(3)自来水洗。
(4)用0.5%盐酸乙醇分化数秒钟。
(5)水洗,用0.1%亚甲蓝水溶液复染2分钟。
(6)用95%乙醇分化,使亚甲蓝脱色,便显示清楚。
(7)无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。